NomNomNylon

Projekt: Projekt skupine DTU Denmark

Uvod

Najlon je naziv za skupino sinteznih polimerov, ki spadajo v skupino poliamidov. Je termoplastičen material, ki ga gradijo monomeri povezani s peptidno vezjo. Široko se uporablja v tekstilni industriji, najbolj znamenit primer so ženske najlonske nogavice. Danes se na široko uporablja za proizvodnjo športnih oblačil, kopalk, puhovk in vetrovk. Vsako leto nastane 92 milijonov ton tekstilnega odpada, napoved za leto 2030 pa je kar 134 milijonov to. Vsako leto namreč nastane 100 milijard novih kosov oblačil. To predstavlja veliko ekološko in tudi ekonomsko breme, saj na letni ravni povzroča izgube v vrednosti 500 milijard ameriških dolarjev. Najlon je eden izmed najzahtevnejših za razgradnjo in reciklažo. Uspešno se ga reciklira samo 2%. V primerjavi z bombažem, ki je biorazgradljiv najlon in poliestreom, ki ga lahko mehansko recikliramo najlon ostaja desetletja preden in se fragmentira v mikroplastiko. Mehansko recikliranje pri najlonu ni uporabno zaradi njegove kompleksne kemične strukture, naprednejši proces kemičnega recikliranje pa je še v zgodnjih fazah razvoja in še ni široko uporabljena metoda. Reševanja problema se je lotila študentska ekipa DTU Denmark na tekmovanju iGEM leta 2025.

O projektu

Ekipa je projekt naredila na podlagi DBTL koncepta kar pomeni Design Build Test Learn oz. v prevodu Načrtuj-Zgradi-Testiraj-Nauči se. Ta združuje računalniško načrtovanje in eksperimentalno delo v laboratoriju. Zasnova projekta je naslednja. Vse se začne s kupom odpadnega najlona, ki predstavlja vir ogljika. Da bi te odpadke predelali, moramo najlon najprej razgraditi na njegove osnovne gradnike.To dosežemo z brezcelično encimsko predobdelavo. Pri tem uporabljamo izboljšano različico encima najlonaze NylC, ki smo jo optimizirali s pomočjo računalniškega načrtovanja proteinov.NylC ima namreč v osnovi nizko aktivnost in ni termostabilen, kar omejuje učinkovitost razgradnje najlona. Tako pripravljene oligomere in monomere nato prevzamejo gensko spremenjene bakterije Pseudomonas putida. Ta vrsta bakterij ima zelo raznolik metabolizem, kar je idealno za uporabo v sintetični biologiji. Spremenjena je tako, da lahko poleg monomerov razgradi tudi oligomere, kar ji omogoča sintetičen nylABC operon inkorporiran v njen genom. Končni produkt z visoko dodano vrednostjo je indigoidin. Gre za biološko pridobljeno nestrupeno barvilo, ki bi nadomestilo sicer petrokemijsko pridobljen indigo. Oba se uporabljata v postopku barvanja kavbojk.

Računalniško načrtovanje

Najlonaze so encimi sposobni razgradnje najlona. NylC začne depolimerizacijo nylon-6, ki je poglaviten v tekstilni industriji. NylC cepi 6-aminohexanoate(Ahx) polimere v oligomere. Deluje poljubno v sredini, kar je ključnega pomena. NylC je N-terminalna nukleofilna (Ntn) hidrolaza. Po procesu samocepitve preide iz nekativno v aktivno obliko encima. Druga hidrolaza je še NylB, ki je aktivna na koncih verig in cepi linearne oligomere v krajše verig. Sledi še NylA, ki specifično prepoznava ciklične dimere in pretvarja cikličen Ahx2 v linearno obliko. NylA, NylB in NylC skupaj tvorijo kooperativen mehanizem,ki nas pripelje do željenega končnega monomera Ahx - 6 - amoniheksanoat. Bakterijski sevi s kateri so delali v nadaljevanju so vsebovali vse tri najlonaze, saj so bili podvrženi procesu ALE - adaptivna laboratorijska evolucija, in so sposobni rasti na različnih monomerih najlona vključno z Ahx.

Omejuje nas dejstvo, da je za proces razgradnje najlona potreben korak predobdelave. Uporablja se NylC, ki pa ima nizko učinkovitost in ni termostabilen. NylC ne zadostuje za tovrstno predobdelavo, saj je pretvorba izvedljiva le nad temperaturo steklastega prehoda najlona, ki je pri približno 55 °C, medtem ko ima encim NylC temperaturo taljenja Tm pri 52 °C. Da bi premagali to oviro, je ekipa zasnovala in razvila postopek za inženirstvo proteinov. Ta uporablja najsodobnejša orodja, temelječa na strojnem učenju, kot sta ThermoMPNN in ESM, ter njihov lastni proteinski jezikovni model Axolotl. Axolotl je difuzijski proteinski jezikovni model zmožen generiranje proteinskih sekvenc de novo. ThermoCraft je visoko zmogljiv in od vrste proteina neodvisen postopek za načrtovanje mutacij za izboljšano termostabilnost in aktivnost. Postopek deluje v načinu za posamezne točkovne mutacije, z uporabo orodja ThermoMPNN in v načinu za hkratno uvajanje številnih sprememb z uporabo modela Axolotl in Pottsovega modela.

Raziskali so tudi encimsko biodiverziteto s pomočjo rudarjenja sekvenc (sequence mining). Temeljilo je na odkritju TvgC, termofilne različice encima NylC. Ta je izjemno termostabilna, Tm= 93°C in je aktivna na najlon-6 in najlon-66 različicah. Ostane termostabilna tudi po enem tednu izpostavljenosti na 60°C. Sistematično so iskali neraziskane termostabilne najlonaze v termostabilnih organizmih s temperaturnim optimumom ≥ 50°C. Naredili so podatkovno bazo proteinov iz termofilov na podlagi podatkovnih baz ThermoBase in UniProt. Pridobljene proteinske sekvence so bile analizirane s pomočjo Foldseek in JackHMMER. Foldseek temelji na strukturnih homologijah, medtem ko JackHMMER na sekvenčnih homologijah. Te analize so obrodile več potencialnih homologov, ki so jih omejili s filtriranjem glede na prisotnost in poravnavo katalitičnih ostankov encima NylC - Lys189, Asn219, Thr267, Asp306 and Asp308. Še višjo raven filtriranja so dosegli z uporabo mrež podobnosti zaporedij (SSN) pri pragu poravnave 100, kar je omogočilo identifikacijo skupine homologov, ki so tesno povezani s TvgC. Na žalost teh homologov zaradi pomanjkanja časa niso uspeli eksperimentalno potrditi in karakterizirati.

Eksperimentalno delo

Karakterizirali so P.putida seve pridobljene iz Institute of BioGeosciences v Julichu. Analizirali so rast sevov KT2440, NYL, NYLON-A, NYLON-B, NYLON-C in NYLON-ABC na različnih virih ogljika. Rast je potekala v mediju MSM. Gre za medij mineralne soli z dodatkom monomerov, dimerov in trimerov najlona in opazovani so bili specifične efekti encimov NylA, NylB in NylC. NYLON-C in NYLON-B sta imela najširši spekter rasti na različnih substratih. Opazovana je bila tudi rast seva NYL, ki lahko preživi izključno na monomerih najlona kot edinemu viru C. Paraleno je potekalo testiranje različnih najlonaz in vitro. Uporabili so 6različnih plazmidov iz Addgene, vsak je kodiral eno NylC različico opisano v literaturi. Različice so bile NylCA in termostabilna verzija NylCA-TS, NylCK in termostabilna verzija NylCK-TS in NylSp2 in termostabilna verzija NylSp2-TS. NylSp2. Eden od kupljenih variantnih plazmidov, NylCp2_pET28a, je služil kot začetna predloga za uvajanje mutacij, ki jih je določil računalniški postopek. Za uvedbo teh mutacij so načrtovali specifične začetne oligonukleotide za usmerjeno točkovno mutagenezo. Po izvedbi mutageneze so plazmide najprej vstavili v bakterijo E. coli DH5α za namnoževanje in preverjanje zaporedja. S Sangerjevim sekvenciranjem so potrdili pravilnost mutacij in plazmide vstavili v E. coli BL21 za izražanje proteinov. Po izražanju smo izvedli drug krog čiščenja, ki je vključeval tako naše načrtovane mutante kot tudi različice iz zbirke Addgene, pri čemer smo vse vzorce obdelali vzporedno po enakem postopku. Vzorci so bili analizirani s tremi metodami: Uvedli so preprosto in učinkovito metodo, ki združuje tankoplastno kromatografijo (TLC) in barvanje z ninhidrinom za analizo razgradnje najlona. Ta metoda na TLC-plošči loči produkte razgradnje najlona (monomere, dimere, trimere in večje oligomere), ki jih nato vizualiziramo z ninhidrinom, ki reagira z aminskimi skupinami. Reakcija z ninhidrinom ob stiku s prostimi amino skupinami povzroči nastanek vijoličnega obarvanja. To je še posebej uporabno za zaznavanje produktov encimske hidrolize cikličnih oligomerov Ahx, ki jo izvaja NylC. Linearni oligomeri Ahx, ki se sprostijo pri endo-delujoči hidrolizi encima NylC, namreč vsebujejo proste amino skupine, ki jih vizualiziramo z omenjeno vijolično barvo. Takšen kombiniran pristop omogoča jasnejši vpogled v encimsko aktivnost in potek razgradnje kot standardni kolorimetrični testi. Metodo je mogoče zlahka ponoviti v drugih laboratorijih in jo uporabiti za testiranje različnih encimov brez potrebe po specializirani opremi. Za identifikacijo produktov razgradnje najlona so uporabili masno spektrometrijo MALDI-TOF. Ta analiza je potrdila, da so naši načrtovani encimi razgradili najlon do monomerov in dimerov, kar je skladno z našimi rezultati TLC. MALDI-TOF prihodnjim ekipam nudi visoko natančno metodo za potrditev encimske aktivnosti in preverjanje rezultatov razgradnje polimerov, kar dopolnjuje vizualne teste. Rezultati teh analiz so bili skladni, da lahko naši encimi učinkovito razgradijo najlon do monomerov in dimerov pri temperaturah do 55 °C. Izmerili so tudi toplotno stabilnost (temperaturo taljenja, Tm) očiščenih encimov, da bi jih primerjali z vrednostmi iz literature in ocenili učinkovitost naših mutant. Najvišji Tm sta imeli varianti NylCK 67.5°C in NylCp2 D122N 64.1°C.Za prikaz uporabnosti načrtovanega seva kot proizvodnega celičnega ogrodja (chassis) so v bakterijo P. putida NYLON-ABC najprej vstavili plazmid za proizvodnjo β-karotena. To je služilo kot dokaz koncepta za izražanje heterologne biosintezne poti. Po potrditvi delovanja so enak delovni postopek uporabili za uvedbo biosintezne poti za indigoidin. Kloniranje genov za indigoidin v sev P. putida NYLON-ABC je vključevalo načrtovanje in optimizacijo Gibsonovega sestavljanja. Proizvodnjo indigoidina so nato karakterizirali tako na tradicionalnih virih ogljika kot tudi z najlonom kot edinim virom ogljika. Poleg tega smo preučili sposobnost barvila za barvanje bombažnih in sintetičnih vlaken.

Zaključek

V bakteriji Pseudomonas putida smo dosegli proizvodnjo pigmenta indigoidina z vstavljanjem kodonsko prilagojenih genov bpsA in pcpS (PPTaza). Načrtovani sev je modri pigment proizvajal tako na glukozi kot tudi med rastjo na gradnikih, pridobljenih iz najlona. To dokazuje, da lahko Pseudomonas uporablja odpadni najlon kot vir ogljika za biosintezo.

S tem smo zagotovili novo celično ogrodje (chassis) in dokaz koncepta poti za pretvorbo plastičnih odpadkov v uporabne ali dragocene izdelke, kar predstavlja temelj za prihodnje ekipe na področju trajnostne proizvodnje. Poleg tega bo ta optimizacija koristila prihodnjim iGEM ekipam, ki bodo z uporabo bakterije Pseudomonas putida razvijale različne izdelke z visoko dodano vrednostjo. Projekt je prispeval 24 osnovnih in 2 kompozitna kosa v iGEM Registry of Standard Biological Parts.

Viri

1.) https://2025.igem.wiki/dtu-denmark/ 2.) https://sl.wikipedia.org/wiki/Najlon