InkSight

InkSight je projekt skupine iz Münchna, ki je bil leta 2025 na tekmovanju iGEM nagrajen kot najboljši na področju diagnostike.

Uvod

Skupina je pri projektu InkSight zasnovala spremenjene sesalske celice v hidrogelu, ki jih je mogoče vbrizgati v povrhnjico kot biosenzorsko tetovažo. Celice lahko prepoznajo specifične biomarkerje v intersticijski tekočini in pri tem sprožijo sintezo melanina, kar povzroči vidno spremembo barve kože. Tak sistem bi omogočal neprekinjeno spremljanje biomarkerjev v realnem času in nadomeščal klasično, včasih invazivno, laboratorijsko diagnostiko. Medtem ko nosljive naprave, kot so pametne ure, omogočajo spremljanje fizičnih in elektrofizioloških signalov, InkSight z inovativnim pristopom to dopolnjuje in zagotavlja neposreden vpogled v biokemijsko in molekularno stanje v telesu.

Opis projekta in rezultati eksperimentov

Za delovanje biosenzorske tetovaže so morali razviti 3 glavne komponente: receptorski sistem MESA (angl. Modular Extracellular Sensor Architecture), ki selektivno zazna biomarker, in proteinske nanokletke ter spremenjene tirozinaze za nadzorovano, lokalizirano in učinkovito sintezo melanina.

Receptorski sistem MESA (angl. Modular Extracellular Sensor Architecture)

Skupina je po obsežni raziskavi izbrala receptorski sistem MESA, saj je modularen (spremenijo lahko vse domene), ne aktivira endogenih signalnih poti in lahko zazna tudi topne ligande.

Receptor je sestavljen iz dveh ločenih transmembranskih verig, vsaka vsebuje ligand vezavno domeno (LBD), transmembransko domeno (TMD) in znotrajcelično efektorsko domeno (IED). Do aktivacije pride, ko se ligand veže na LBD obeh verig in sproži dimerizacijo receptorja MESA. Tako se znotrajcelična proteaza na eni verigi receptorja, kot je proteaza TEV (proteaza iz virusa jedkanja tobaka), približa mestu cepitve na drugi verigi in sproži cepitev, kar vodi v sprostitev tovora, običajno transkripcijskega faktorja, ki potuje v jedro ter uravnava izražanje reporterskega gena. Pri takem sistemu so naleteli na dve glavni težavi, in sicer, da zaradi prehodne dimerizacije lahko pride do neželene aktivacija receptorja v odsotnosti liganda, in da se receptor včasih ne uspe pravilno zasidrati v membrano. Da bi se temu izognili so uporabili optimizirane TMD in razcepljene proteaze.

MESA Designer in eksperimentalna potrditev delovanja receptorskega sistema

Zahtevna je tudi izbira ustrezne LBD, na primer pri malih molekulah brez znanih naravnih receptorjev. Pri načrtovanju novih receptorjev so si zato pomagali z lastnim programskim orodjem MESA Designer. Ta ima integrirano bazo SAbDab (The Structural Antibody Database), ki vsebuje več kot 10 000 eksperimentalno potrjenih struktur protiteles med katerimi poišče take, ki bi lahko vezali tarčni antigen, ter preveri afiniteto vezave z orodjem SKEMPI v2.0 (Structural database of Kinetics and Energetics of Mutant Protein Interaction). MESA Designer omogoča tudi vnos lastnega zaporedja LBD in pomaga pri izbiri različnih kombinacij TMD, povezovalnih zaporedij, proteaz itd. Program potem samodejno generira genske konstrukte, pripravljene za uporabo v laboratoriju.

Da bi preverili delovanje programsko načrtanega membransko vezanega receptorja, ki veže fragment Fc protitelesa IgG, so celice HEK293T transfecirali z ustreznimi konstrukti, po 12 urah so izvedli indukcijo z ligandom, rezultate pa posneli 24 ur kasneje s fluorescenčno mikroskopijo. Znotrajcelični del receptorja MESA sestavljata N- in C-fragment razcepljene proteaze TEV, ki se po vezavi liganda povežeta v aktivno proteazo. Ta nato cepi v membrano zasidran tetraciklinski transaktivator (tTA), ki je povezan z modrim fluorescenčnim proteinom (BFP). tTA se po cepitvi prenese v jedro in se veže na odzivni element za tetraciklin (TRE) ter aktivira izražanje rumenega fluorescenčnega proteina (YFP). Pri treh kontrolnih vzorcih (receptor MESA, receptor MESA + tTA-BFP, receptor MESA + konstrukt za YFP) pričakovano niso opazili modre in rumene fluorescence. Presenetljivo je, da pri kontroli s kombinacijo receptorja in tTA-BFP ni bilo opaznega signala modre fluorescence, čeprav bi se BFP moral izražati na membrani celic. Raziskovalci tega niso pripisali neuspešni transkripciji, pač pa prenasičenju tTA-BFP, saj ta nima mesta, kamor bi se tarčno vezal. Posledično lahko pride do nepravilnega zvitja proteina, celo njegove razgradnje ali do dušenja fluorescence. Ko so celice transfecirali s celotnim sistemom (MESA + tTA-BFP + YFP) so pri neinduciranem stanju opazili šibko modro in rumeno fluorescenco, kar kaže na nizko stopnjo bazalne aktivacije. Po indukciji z IgG Fc se je signal YFP močno ojačal, modra fluorescenca pa je ostala podobna neinduciranem. Tako so uspešno validirali receptor, zasnovan z orodjem MESA Designer.

Enkapsulini

Pri sintezi melanina ali melanogenezi, kjer sodeluje encim tirozinaza, nastajajo poleg evmelanina (rjavo-črn pigment) in feomelanina (rumeno-rdeč pigment) še drugi intermediati, ki so citotoksični in mutageni. Pri sesalcih zato sinteza ne poteka prosto v citosolu celic, pač pa v specializiranih membranskih organelih, melanosomih. Skupina se je odločila posnemati to »strategijo« z uporabo bakterijskih enkapsulinov, ki se sami sestavijo v nanokletke. Te so termično stabilne in odporne na spremembe pH.

Skupina je izbrala enkapsuline iz treh različnih bakterijskih sevov, ki se razlikujejo po velikosti in simetriji, kar ponazorimo s številom T, ki pove, koliko enakih podenot sestavlja proteinsko kletko. Najmanjšo različico nanokletke (T = 1, 60 podenot), ki je bila velika približno 18 nm, so sestavljali enkapsulini bakterijskega seva Thermotoga maritima (Tm). Za srednje veliko nanokletko (T = 3, 180 podenot), velikosti približno 32 nm, so izbrali enkapsuline iz bakterij Myxococcus xanthus (Mx), kot največjo preučevano nanokletko (T = 4, 240 podenot), ki meri 42 nm, pa so izbrali enkapsuline iz bakterijskega seva Quasibacillus thermotolerans (Qt). Pore nanokletk so bile velike 2–11 Å, kar omogoča difuzijo tirozina, hkrati pa preprečuje izhajanje melanina.

Eksperimentalno so preizkusili tri različne enkapsulinske sisteme, in sicer »gole« enkapsuline, ki se sestavijo spontano, pro-enkapsuline, katerih sestavljanje je regulirano s proteazo TEV in enkapsuline v fuziji s tirozinazo. Vsi enkapsulinski konstrukti so imeli tudi zapis za izboljšan zeleni fluorescenčni protein eUnaG (angl. enhanced Unagi Green fluorescent protein). Sestavljanje nanokletk so spremljali z nativnim PAGE, najprej so na gelu vizualizirali samo enkapsuline preko fluorescence, nato pa so ga obarvali še s Coomassie Blue.

Pri »golih« enkapsulinih so uspešno pokazali, da se Mx (srednje velikosti) in Tm (najmanjši) spontano sestavljata neodvisno od proteaze TEV, kar vidimo kot liso v zgornjem delu gela. Vzorec Mx, ki je bil kotransfeciran z zapisom za tirozinazo pa je ostal v žepku. Podobno se je Qt (največji) verjetno vseeno sestavil v nanokletko, vendar zaradi svoje velikosti ni vstopil v gel.

Da bi lahko nadzirali sestavljanje nanokletk, so raziskovalci zasnovali pro-enkapsuline, ki so vsebovali domeno LBT-15, ki veže lantanoide, v njihovi odsotnosti pa intrinzično neurejen del te domene onemogoča sestavljanje enkapsulinov. Nanokletke se torej tvorijo le, ko proteaza TEV odcepi LBT-15. To so uspešno pokazali na gelu pri vzorcih Mx in Tm, saj so bili prisotni monomeri na dnu gela, ob dodatku proteaze TEV pa so se uspešno tvorile nanokletke, kar so opazili kot liso na vrhu gela. Pri pro-enkapsulinih Qt po dodatku proteaze ni bilo vidne nobene lise, kar lahko pomeni, da se je nanokletka dejansko sestavila, a je bila prevelika in ni vstopila v gel ali da do izražanja sploh ni prišlo.

Nazadnje pa so analizirali še konstrukte, kjer je bila tirozinaza v fuziji z »golimi« različicami enkapsulinov. Pri vzorcih z enkapsulini Mx in Qt je bila opazna lisa v žepku. To potrjuje uspešno sestavljanje nanokletk, kljub fuziji. S tem so ovrgli prvotne računalniške napovedi, s katerimi so predvideli, da bi fuzija s tirozinazo lahko sterično ovirala tvorbo proteinskih kletk. Pri enkapsulinih Tm pa ni bilo vidne lise, kar kaže na neuspešno izražanje ali sestavljanje nanokletke. Poleg samega sestavljanja enkapsulinov pa jih je zanimalo tudi, ali tirozinaza znotraj take strukture ohrani svojo aktivnost. Meritve absorpcije pri 900 nm so potrdile aktivnost v nanokletkah Mx in Qt, sinteza melanina je bila znatno višja kot pri negativnih kontrolah.

Tirozinaze

Ključen encim biosenzorskega sistema je tirozinaza, ki ima v aktivnem mestu prisotna dva bakrova iona, koordinirana s šestimi His. Poleg osrednje domene iz štirih α-vijačnic, lahko tirozinaze vsebujejo še N-končno domeno (NTD) in C-končno domeno (CTD), ki uravnavata aktivnost. Ekipa si je izbrala tri glavne pristope regulacije tirozinaz. Prvi je bil z razcepljenimi tirozinazami, ki se aktivirajo šele, ko se uspešno sestavijo proteinske nanokletke (BmTyr iz Bacillus megaterium). Drugi pristop je povezan s proteinom Caddie, ki prenaša baker v aktivno mesto in je zato nujen za delovanje, aktivacija pa je zopet vezana tudi na sestavljanje nanokletke (tirozinazi SavMel iz Streptomyces avermitilis in SkMel iz Streptomyces kathirae). Zadnji temelji na C-končni domeni Lid, ki kot »pokrov« blokira dostop substrata do aktivnega mesta. Encim se aktivira šele po proteolitični cepitvi domene (tirozinazi HcTyr1 iz Hahella in VsTyr iz Verrucomicrobium spinosum).

Po neuspešnih poskusih izražanja v brezceličnem sistemu, so naredili transformacijo celic E. coli BL21[DE3] z vektorjem pET21b, ki je nosil zapis za različico tirozinaze. Očiščene encime so nanesli na NaDS-PAGE, nato so preverili še aktivnost z merjenjem absorbance pri 490 nm. Zaradi časovne stiske in težav niso uspeli izolirati, očistiti in detektirati tirozinaz. Izjema je bila le HcTyr, ki so ji nato dodali proteazo TEV in izmerili povečanje absorbance, s čimer so potrdili uspešno sintezo melanina s pristopom z domeno Lid.

Viri

[1] Inksight. InkSight - The Living Tattoo. https://2025.igem.wiki/munich/ (pridobljeno 3. maj 2026).