Tehnologija rekombinantne DNA

TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNA

NOVO

[20.10.] Naslednji izpitni rok bo 8. decembra ob 13:15 v predavalnici 223 na Aškerčevi.

[5.10.] V tem semestru bodo govorilne ure ob četrtkih ob 15. uri, lahko pa se najavite na konzultacije v času, 
ko sem prisoten - okvirni razpored zasedenosti je na mojem koledarju. 

 [8.6.'09] Za vse, ki ne veste, kje so stara izpitna vprašanja - tule so.

Odgovori na vprašanja

(1) Na konzultacijah se je pojavilo vprašanje, zakaj retrovirusi ne morejo okužiti celic, ki se ne delijo (poglavje o genskem zdravljenju). Problem je v tem, da pri celicah, ki se ne delijo, ne pride do integracije z reverzno transkriptazo prepisanega virusnega genoma v genom okužene celice. Obstajajo tri možne razlage, zakaj to ni možno. Po prvi naj bi bila integracijska mesta v normalnem kromatinu nedostopna, po drugi naj bi v procesu podvojevanja DNA in delitve celice integracijski kompleks lažje dostopal do tarčnih mest, po tretji pa naj bi celični proteini, ki se vežejo na DNA med podvojevanjem, omogočili sestavljenemu integracijskemu kompleksu usmerjen dostop do vključitvenih mest. Proces integracije retrovirusne DNA v genom gostiteljske celice je natančno razložen v članku v Trends in Genetics (2006).

(2) Pri predavanjih nisem dobro razložil postopka onkolize z adenovirusi. Za ilustracijo si oglejte slike v sklopu L2. Ključno za razumevanje je, da veste, da je protein p53 tumorski supresor, ki je v tumorskih celicah najpogosteje nefunkcionalen. Okužba zdravih celic (p53 deluje normalno) z divjim tipom adenovirusa povzroči od p53-odvisno apoptozo, ki pa se izrazi tako počasi, da se medtem virus še lahko namnoži. Za tako zakasnjeno sprožitev apoptoze mora priti do interakcije med virusnim proteinom E1B in celičnim p53. Če pripravimo viruse z delecijo gena E1B, potem zakasnitve apoptoze v zdravih celicah ne bo, kar pomeni, da se v zdravih celicah virus ne bo mogel razmnoževati. V tumorskih celicah pa protein p53 ni funkcionalen, torej do apoptoze ne more priti, zato se adenovirus lahko namnoži, celico uniči, hkrati pa namnoženi virusi lahko okužijo sosednje celice. O izkušnjah z adenovirusnimi in drugimi onkolitičnimi virusnimi preparati si lahko več preberete v kratkem članku iz Lanceta, o mehanizmu delovanja pa precej natančno v reviji Oncogene. Vedeti je treba, da je adenovirus treba injicirati čimbolj natančno v tumor, tako da je škoda za okoliške zdrave celice, ki do neke mere res odmrejo, kar najmanjša.

Podatki o predmetu

Izvedba predmeta	Predavanja: 60 ur, zimski semester 4. letnika univerzitetnega študija biokemije; skupni predmet (za vse sklope) Vaje: 60 ur, druga polovica poletnega semestra 4. letnika univerzitetnega študija biokemije; predmet samo za študente sklopa A.
Predavatelj	doc. dr. Marko Dolinar
Urnik 2008/09	zimski semester: sreda 16:00 do 18:00 in petek 12:30 do 14:30 v predavalnici D30 na dekanatu Dvourna predavanja imajo ~10 minutni odmor.
Govorilne ure	V času semestra vsak četrtek od 15h do 16h in/ali po predhodnem dogovoru po telefonu (01) 2419-480; oglasite se na Jamovi 39 ( Institut "Jožef Stefan"), stavba B, soba 109.
Izpitni roki 2010/11	zimsko izpitno obdobje: okrog 25. januarja 2011 poletno izpitno obdobje: okrog 10. junija 2011 jesensko izpitno obdobje: okrog 30. avgusta 2011 (Vsak absolventski letnik si lahko izbere en rok po lastni izbiri - to velja za vsakokratni tekoči absolventski letnik samo enkrat in pri tem predmetu. V št. letu 2008/9 je bil ta rok 26.7.2010.) Samo absolventom bosta namenjena dva roka zunaj izpitnih obdobij: konec novembra 2010 sredina aprila 2011 Od 4. opravljanja dalje je treba izpit plačati, zato se na izpitni rok prijavite samo, če ste prepričani, da ste se snov dobro naučili in ste jo sposobni tudi kritično uporabiti na primerih. Prijavnic študentom, ki ne bodo prišli na izpit, ne nameravam vračati, saj za to ne vidim nobenega razloga. Odjave pred izpitom pa upoštevam - ne glede na razlog za odpoved - do trenutka, ko začnem deliti izpitne pole. V preteklem študijskem letu so bili izpiti: 1.12., 19.2., 20.4., 21.6., 26.7. in 30.8.
Diplomska dela	Teme in pogoji za opravljanje diplomskih nalog s področja tehnologije rekombinantne DNA na Katedri za biokemijo v študijskem letu 2009/10: priprava evkariontskega ekspresijskega vektorja, izražanje in analiza rekombinantnih fuzijskih proteinov, razvoj sinteznobiološkega sistema za mutagenezo, vpliv N-končnih zaporedij na raven izražanja in topnost rekombinantnih proteinov. Na Institutu "Jožef Stefan" obstaja možnost priprave več diplomskih nalog na treh odsekih s področja biokemije in molekularne biologije B1, B2, B3.
Študijska literatura	Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak: Molecular Biotechnology, Principles and applications of recombinant DNA, 3rd edition, ASM Press, Washington, 2003 [ISBN 1-55581-269-4] Par izvodov 2. izdaje je bilo naročenih za knjižnico (FKKT/CTK). Cena pri založbi je bila 57 USD. V knjigi je biotehnološki del razložen bolj obširno, kot je potrebno za ta predmet. Študirate še lahko po 2. izdaji; tudi strani zgoraj, v opisu tem, se nanašajo na 2. izdajo, ki  je na voljo v CTK (2 izvoda) in na Veterinarski fakulteti (piše v Cobissu). Pomožni učbenik: Sandy Primrose, Richard Twyman, Bob Old: Principles of Gene Manipulation, 6th edition, Blackwell Science, Oxford, 2001 (cena pri založbi je 29.50 GBP; moj osebni izvod si lahko sposodite za kakšen dan, če želite). Povezava zgoraj vas pripelje na domačo stran učbenika, kjer je tudi nekaj slikovnega gradiva in vprašanj za ponavljanje snovi (v glavnem so lahka). Ker idealnega učbenika ni, bo nekaj poglavij povzetih po drugih virih - te bom navedel na predavanjih in po možnosti sproti dopolnjeval na tej strani.
Cilji	Pričakujem, da boste po opravljenem izpitu znali po stopnjah razložiti, kako ustvarimo rekombinantni organizem, da boste razumeli biokemijsko naravo postopkov in reakcij, ki so za to potrebni, da boste (z nekaj občutka za živi svet) zagovarjali svoje mnenje o etičnih in strokovnih vidikih genske tehnologije. Po opravljenem izpitu bi morali biti sposobni razumeti metodološki del dobro napisanega strokovnega članka s področja molekularne biologije, ki vključuje gensko-tehnološke pristope. Prav tako mislim, da bi študenti morali znati sami sestaviti zaporedje reakcij, ki so potrebne za določen poskus. Za študente, ki bodo opravljali tudi vaje, pa pričakujem, da bi nekatere osnovne tehnike bili sposobni tudi ponoviti po članku/patentu in da bi znali sami načrtati nekaj osnovnih poskusov (vključno z mikrolitri posameznih reagentov v reakciji).
Potek predavanj	Teme po datumih so v spodnji tabeli. Vsebine tematskih sklopov so na dnu strani. Predavanja bodo po urniku: po 2 uri z vmesnimi ~10 minutami odmora. Večina predavanj bo v obliki razlag. Zadnji 2 uri pred izpitom sem si predstavljal kot klasični colloquium - pogovor o stvareh, ki se vam ne zdijo dorečene, dobro razložene, ki vas mučijo strokovno, etično, kakorkoli. Ta pogovor se po navadi ne posreči v celoti kot si ga predstavljam, vsekakor pa je to priložnost, da razjasnimo stvari, ki so bile morda nejasne med predavanji. Zadnji dve leti za izvedbo tega razgovora ni bilo časa. Če vnaprej veste, da ne boste mogli priti (kot letnik) na kakšno predavanje, mi to prosim sporočite vnaprej. V takem primeru se bomo dogovorili, ali temo predelamo samo shematsko ali jo nadomestimo kasneje oz. v drugem terminu. Predavanj je 60 šolskih ur in toliko jih moram/želim tudi imeti. Izjeme so seveda ure, ki padejo na dneve, ki jih fakultetni koledar vnaprej določi za proste. Če vas bo na predavanja prišlo manj kot 5, teme ne bom podrobno razlagal, pač pa samo orisal glavne značilnosti. Na predavanjih želim, da me prekinete, čim vam razlagana snov ni jasna. Teme niso zapletene, računanja pri teoretičnem delu praktično ne bo, tudi ne kakšnih izpeljav in podobnega. Upam, da boste o temah razmišljali pred in/ali po predavanjih, ne samo na koncu, med izpitom. Po koncu predavanj bo pisni izpit s kratkim ustnim zagovorom (praviloma ne več kot 1 teden po pisnem izpitu) za vse študente, ki so opravili pisni del. Teoretični sklopi (A-G) so osnova za razumevanje aplikativnih tem (H-M); vprašanja bodo z obeh področij. Teme iz sklopa N ne pridejo v poštev za izpit (kar ne pomeni, da vas ne pričakujem na teh predavanjih), zato se za prvi rok lahko začnete pripravljati že med novoletnimi prazniki. V pomoč pri preverjanju učenja so vam lahko tudi vprašanja s prejšnjih rokov.
Ocenjevanje Statistika Fakultativni seminarji in končna ocena predmeta Popravljanje ocene Absolventi	Ob vsakem izpitnem vprašanju bo navedeno število točk, ki jih dobite za povsem pravilen odgovor, tako da se lahko bolj posvetite vprašanjem, ki prinašajo več točk. Tudi kriterij za ocenjevanje je znan vnaprej in je povsem aritmetičen in neodvisen od raznih statističnih razrezov. Iz dosedanjih izkušenj lahko rečem, da se študentom pisni izpit zdi težji, kot so pričakovali. Na ustni del izpita lahko pride samo, kdor zbere pri pisnem izpitu vsaj 55 % vseh možnih točk (ocena 6). Statistka za leto 2010 kaže, da je pozitivno oceno dobilo (na posameznih rokih) med 54 % in 75 % prijavljenih študentov. Povprečje doseženih točk na posameznih rokih je bilo med 49 % in 63 %, povprečje končnih ocen na vseh 5 rokih v tem letu pa je bilo 7,37 (to je nekoliko bolje kot leta 2006 in zelo podobno kot leta 2008, a precej slabše kot npr. leta 2007, ko je bila povprečna ocena 8,04). Ocene so bile 1-krat 10, 2-krat 9, 7-krat 8, 7-krat 7 in 11-krat 6. Kdor bi želel predstaviti kakšen seminar (15-20 minut), naj se javi pri meni, da se dogovoriva za temo in termin. Uspešna predstavitev prinese do 5 % točk, ki se dodajo točkam pisnega izpita (teoretično lahko torej s tem zberete 105 %). Pri ustnem delu izpita (ki naj ne bi bil daljši kot 20 minut) lahko oceno s pisnega dela popravite ali poslabšate za do 2 oceni (primer 1: pisali ste 61 %, to bi bilo 6, odgovarjate izjemno dobro, popravite na največ 8; primer 2: pišete 81 %, kar je 8, pripravili ste še kar dober seminar, zato dobite še 4 %, skupaj 85 % (to bo že 9), nato pa izrečete veliko neumnost na zagovoru in končna ocena bo 7). V preteklosti je bilo nekaj nejasnosti glede ocenjevanja, zato poudarjam, da je uspeh pri pisnem delu osnova za končno oceno; na zagovoru lahko preverim manj tem, zato ta del šteje manj. Pričakujem pa, da bo zagovor v okviru znanja na pisnem delu - v tem primeru se ocena ne spremeni, če pa pri zagovoru pokažete boljše ali slabše znanje, kot je kazalo pri pisnem delu, lahko to oceno spremeni za eno, pri ZELO slabem ali ZELO dobrem znanju pa za dve oceni. Oceno z izpita je mogoče popraviti. Popravljanje je mogoče samo enkrat in samo na enem od razpisanih izpitnih rokov. V skladu s priporočilom Rektorata UL (spomladi 2002) velja ocena, ki je višja. Ocene s komisijskega roka ni mogoče popravljati (sklep Študijske komisije FKKT iz leta 2007). Absolventi opravljajo izpit na rednih rokih za študente 4. letnika in po programu tekočega letnika. Razen tega sem letos za absolvente razpisal še dva izredna, t.im. absolventska roka. Ker morate absolventi znati tekočo snov, bom občasno objavljal, katere teme so spremenjene/dodane.
Ostalo	Koristne povezave Komentarji, vprašanja in odgovori glej spodaj na tej strani

Teme po datumih v štud. letu 2010/11

(teme so opisane pod tabelo v predmetniku)

datum	tema	datum	tema
6. oktober	A1	8. oktober	A2
13. oktober	A2	15. oktober	B1
20. oktober	B2	22. oktober	B2
27. oktober	C1	29. oktober	C1, C2
3. november	C2	5. november	D1
10. november	D1,D2	12. november	D2
17. november	E1	19. november	E2
24. november	F1	26. november	F2
1. december	G1	3. december	G2
8. december	H1-2	10. december	predvidoma H1 - predava K. Drobnič
15. december	I1	17. december	I2
22. december	J1	24. december	J2
29. december	ni predavanj	31. december	ni predavanj
5. januar	K1	7. januar	K1,K2
12. januar	K2	14. januar	L1
17. januar	L2	19. januar	M1
24. januar	M2	25. januar	N1-2

Predmetnik

oznake: MB...Glick & Pasternak: Molecular Biotechnology (strani se nanašajo na starejšo 2. izdajo, ki je tudi v CTK), PGM...Primrose, Twyman & Old (pomožni učbenik; številke so strani, ki obsegajo določeno temo): Principles of gene manipulation, 'Maniatis'...Sambrook&Russel: Molecular cloning. A laboratory manual.
Razdelitev po 2-urnih sklopih in osnovna literatura:

A1 Namen predmeta, potek predavanj; osnove tehnologije rekombinantne DNA, zgodovina [MB 3-12] (več kot malo tudi na WWW), zakonodaja (SI: Zakon o ravnanju z GSO; predpisi EU; konvencija o člov. pravicah v zvezi z biomedicino in protokol o prepovedi kloniranja človeških bitij);
A2 Laboratorijski organizmi [MB 13-18]; varnost Slovenski portal biološke varnosti; ameriški standardi: navodila NIH

B1 Elektroforezne metode (nekatere osnove na straneh Colorado State University). Encimi v tehnologiji rekombinantne DNA [MB 45-51 + 'Maniatis', PGM 26-42]
B2 Vektorji [MB 51-59; 68-74; PGM 43-84]. Reporterski geni pregled reporterskih sistemov v reviji The Scientist 7/2001).

C1 Sinteza cDNA, priprava knjižnic [MB 59-68; PGM 83-119]. Transformiranje celic [MB 74-75].
C2 Sinteza DNA in vitro. Različne izvedbe PCR. [MB 79-108; PGM 19-25]

D1 Hibridizacija, sonde – načini označevanja [MB 59-66 + označevanje sond]. Določanje nukleotidnega zaporedja [MB120-132].
D2 DNA-mikromreže sestavek v Wikipediji, na gene-chips.com in pregled (2005) v reviji The Scientist; gradivo za ameriške srednje šole.

E1 Ekspresijski sistemi - splošno (opisi nekaterih metod na straneh EMBL - deluje v programu Internet Explorer).
E2 Izražanje v prokariontih: vektorji, fuzije, optimizacija proizvodnje; usmerjena lokalizacija, topnost, stabilnost in renaturacija ([MB 109-143 + renaturacije: kratek pregled; PGM 139-155).

F1 Izražanje v kvasovkah in nitastih glivah [MB 145-154; PGM 156-173].
F2 Izražanje v gojenih živalskih in človeških celicah [MB 154-169; PGM 174-220].

G1 Mutageneza – pristopi; proteinsko inženirstvo. [MB171-195; PGM 132-138]
G2 Predstavitev na fagih ([MB122-124 + pregledni članek W.G.T. Willats, Plant Mol. Biol., 2002). Dvohibridni sistem kvasovk - nekaj podrobnosti; princip dvohibridnega sistema PPT in uporaba pri iskanju proteinov, ki interagirajo PPT - avtor Bruce Jenks, Univ. Nijmegen, Nizozemska.

H1 Forenzična genetika / prstni odtis DNA (glej tudi poglavje v Wikipediji, za začetek morda tudi sestavek na kemija.org). Predavala bo predvidoma prof. dr. Katja Drobnič s Centra za kriminalistično-tehnične preiskave MNZ.
H2 DNA-diagnostika [MB206-224]. Uporaba TrDNA v sistematiki in ekologiji (teorija in preprost primer). Proizvodnja rekombinantnih reagentov [MB227-276].

I1 Molekularna biotehnologija: uporaba rekombinantnih organizmov [MB 277-309], uporaba biomase [MB 311-345].
I2 Rekomb. bakterije v agronomiji [MB 347-397]. Rekombinantna DNA v rastlinskih sistemih [MB227-276, PGM 221-246].

J1 Uporaba rastlin v molekularni biotehnologiji (MB 445-477; kratek poljudni uvod tudi na WWW). Gensko spremenjena hrana (dileme: glej novice nasprotnikov GSH na WWW).
J2 Izvorne celice (uvod in osnovni pojmi na strani NIH; izvorne celice na Kimball's Biology Pages; poljudni članek Nejca Jelena o izvornih celicah in njihovi uporabi - na kemija.org: " 1. del, " 2. del). Transgenske živali [MB 479-505, PGM 247-273].

K1 Tehnologija izbijanja genov (splošen uvod na straneh revije The Scientist). Utišanje genov z RNAi (osnove v animaciji revije Nature Reviews Genetics - zahteva pripomoček FlashPlayer; Nobelova nagrada za fiziologijo 2006 - razlaga. Kloniranje sesalcev splošno, seznam doslej kloniranih sesalcev in poglavje o kloniranju živali na Wikipediji; povzetek v reviji Nature: 10 let po objavi članka o ovci Dolly).
K2 Projekt Človekov genom posebna ševilka revije Science ob objavi zaporedja človekovega genoma, novica v reviji Nature in povezave). Določanje zaporedij drugih genomov genomski projekti na Wikipediji).

L1 Genomika – proteomika (o ~ómikah v reviji Nature; proteomika na Wikipediji). Farmakogenomika sestavek na NCBI).
L2 Tehnologija rekombinante DNA v medicini. Gensko zdravljenje [MB555-590]. Aptameri na Wikipediji

M1 Patentiranje, dileme, možnosti. (MB 591-620; slovenska zakonodaja (v formatu PDF), evropska patentna konvencija).
M2 Etika ter družbena sprejemljivost. Patentiranje v genetiki in Etični, sociološki in zakonodajni vidiki na straneh programa Človekov genom; Etična vprašanja v biotehnologiji; UNESCO: Svetovna deklaracija o človekovem genomu in človekovih pravicah).

N1-2 Novi pristopi v tehnologiji rekombinantne DNA (nove tehnike, reagenti in pristopi pri kloniranju in čiščenju rekomb. proteinov; pregled novih sistemov na trgu)

O1 ponovitve, poglabljanje, odprta vprašanja
O2 zaključni pisni izpit in zagovor
__

*(za prebiranje WWW strani se morate prijaviti v BioMedNet, je pa zastonj in vam omogoča dostop do še več drugih virov in informacij s področja molekularne biologije in biomedicine).

'Maniatis': tako na kratko imenujemo laboratorijski priročnik, ki je bil pred leti številka 1 v laboratorijih, saj vsebuje osnovne razlage in veliko postopkov za delo. Pravi vir je: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. Obstaja tudi 3. izdaja. Ne poskušajte si te knjige izposoditi v knjižnicah, ker jo povsod rabijo v laboratorijih. Tudi kupovati je nima smisla, razen če nameravate odpreti lasten laboratorij. Enako uporabna in (ne)dostopna je 'rdeča knjiga ', uradno F.M. Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons - trenutno 5 debelih map protokolov in razlag. Ker boste res rabili samo nekaj strani, se pri študiju tehničnih postopkov lahko oprete na kopije slik s predavanj, ki vam jih bom dal.

Stara izpitna vprašanja

(2002/03, 2. rok)
1. (3) Kaj pomenita pojma homologen in heterologen ekspresijski sistem?
2. (3) Katere so prednosti in slabosti izražanja genov v insektnih celicah v primerjavi z drugimi gostiteljskimi organizmi?
3. (2) Kakšno je skupno število baznih parov v genomu riža?
4. (9) Opiši vektor (čemu služijo posamezni zapisi in regije na vektorju)! Za katere gostiteljske organizme ga lahko uporabimo? Kako lahko induciramo izražanje rekombinantne sintetaze? (slike ni on-line, ker je iz nekega članka – šlo je za ekspresijski vektor za E. coli)
5. (4) Naštej 4 primere uporabe mestno-specifične mutageneze?
6. (3) Zakaj pride do zaustavitve podaljševanja verige pri dodatku terminatorjev v sekvenčni reakciji?
7. (6) V blatu ob jezeru Turkana so našli mumificirani trupli dveh osebkov, enega odraslega in enega otroka. Kako bi na osnovi njune DNA ugotovili, ali gre za starša z otrokom ali ne?
8. (4) Opiši postopek hibridizacije fragmentov genomske DNA E. coli! Sonda je že pripravljena in detekcija bo potekla po navodilih proizvajalca – pripraviti je treba samo genomsko DNA za analizo.
9. (6) Opiši princip delovanja dvohibridnega sistema na osnovi proteina Gal4!
10. (5) Kaj vse lahko usmerjeno spreminjamo pri sončnicah za večji hektarski donos in kvaliteto semen?
11. (4) Kaj pomeni oznaka His-tag, kje se pojavlja in katere so lastnosti rekombinantnih proteinov, ki vključujejo to oznako?
12. (5) Kako bi lahko detektirali točkovno mutacijo v genu za laktalbumin s pomočjo 3 začetnih oligonukleotidov in fluorescenčnim označevanjem produktov?
13. (3) Naštej 3 lastnosti episomskih vektorjev za kvasovke!
14. (3) Po katerem principu poteka ločevanje nastalih produktov pri avtomatskih sekvenatorjih DNA?

Rezultati pisnega dela izpita

(tabela pripravljena za vnos podatkov)

vpisna številka (3001xxxx)	doseženih % (ocena)	ustni del izpita

Kriterij za ocene iz pisnega dela je: 56%-65% za 6, 66%-74% za 7, 75%-82% za 8, 83%-90% za 9, >90% za 10.
V sistem e-študent vpisujem tudi negativne ocene po kriteriju: 0%-11% za 1, 12%-23% za 2, 24%-34% za 3, 35%-45% za 4, 46%-55% za 5.
==================

Koristne povezave

• Kako čemu rečemo po slovensko? Terminološka komisija pri Slovenskem biokemijskem društvu
• Katedra za biokemijo Fakultete za kemijo in kem. tehnologijo Univerze v Ljubljani
• Razlage nekaterih osnovnih pojmov, novice, strani za študente in predavatelje s področja molekularne biologije, biotehnologije, tehnologije rekombinantne DNA: Access Excellence - tudi slikovno gradivo.
• Slovar biotehnoloških izrazov (vsi slovarji so v angleščini).
• Slovar genetskih izrazov
• Slovar celične biologije;
• Slovar biotehnologije in genetskega inženirstva (FAO)

Komentarji, vprašanja in odgovori:

Na strokovna vprašanja bom poskušal odgovoriti na predavanjih, če pa niste moji študenti, pa na kratko tudi po e-pošti.
Pišite mi tudi, če katera od povezav na tej strani ne deluje več ali če veste za kakšno drugo dobro povezavo, ki bi jo veljalo vključiti.