Semikonzervativno podvajanje

Semikonzervativno podvajanje (Slika 1) je metoda, po kateri se DNK podvojuje v vseh celicah.

Podvajanju, pri katerem se polovica starega ohrani, pravimo semikonzervativno podvajanje. Hčerinski molekuli DNK vsebujeta vsebujeta po eno staro in eno novo polinukleotidno verigo, ki je komplementarna stari verigi. Novonastali hčerinski molekuli DNK sta med seboj enaki (identični), imata enako zaporedje nukleotidov. Enako zaporedje nukleotidov je imela tudi materinska molekula DNK. Novonastali molekuli se lahko podvajata na enak način in to omogoča prenašanje nespremenjenega dednega materiala iz celice v celico, iz generacije v generacijo. Ker se lahko DNK vedno znova podvaja, rečemo tudi da se replicira.

Poskus, s katerimi so potrdili semikonzervativno podvajanje

Osnove poskusa

Teorija semikonzervativnega podvajanja je osnovana na dejstvu, da je DNK zgrajena iz dušikovih baz. Pri dušiku poznamo izotop ¹⁵N (najbolj pogost izotop je ¹⁴N imenovan tudi "težki" dušik. Meselson-Stahl-ov poskus (Slika 2) pa izkorišča ravno to razliko v teži med različnimi izotopi dušika (Slika 3).

Izvedba poskusa

Bakterije Escerichia coli, ki sta jih gojila, sta razdelila v dve skupini. Kontrolno skupino bakterij E. coli sta gojila na gojišču z običajnim dušikom ¹⁴N. Vsa DNK, ki so jo bakterije sintetizirale, je vsebovala ¹⁴N in je bila "lahka". Testno skupino bakterij pa sta gojila na gojišču, v katerem je bil edini dostopni dušik težki dušikov izotop ¹⁵N. Bakterije sta več generacij gojila na takem gojišču. Vse molekule, ki so bile zgrajene iz dušika - tudi DNK, so vsebovale izotop ¹⁵N. Tako je vsa bakterijska DNK postala "težka" in tako so bakterije tudi označili. Z izotopi ¹⁵N in ¹⁴N označeno DNK so izločili (ekstrahirali) iz celic in jo s centrifugiranjem ločili od ostalih molekul in delov celice. To so naredili tako, da so dali vzorec DNK v centrifugirko na vrh raztopine cezijevega klorida (CsCl) z naraščajočo gostoto. Med centrifugiranjem so se različno težke molekule DNK razporedile po raztopini tako, da so se zadržale tam, kjer je bila gostota raztopine enaka njihovi gostoti. Težje molekule imajo večjo gostoto. DNK s težkim dušikom se je ustavila blizu dna, medtem ko se je lahka DNK zadržala blizu vrha centrifugirke. Vsa DNK iz gojišča ¹⁵N je bila "težka", vsa DNK iz gojišča z ¹⁴N pa lahka.

Potem sta bakterije, označene z ¹⁵N, prenesla na gojišče z normalnim, "lahkim" dušikom ¹⁴N in pustila, da so se bakterije enkrat delile. Dobila sta 1. generacijo. S centrifugiranjem sta ugotovila, kakšno gostoto("težo") je imela DNK bakterij prve generacije. Postopek sta ponovila še za 2., 3. in več nadaljnih generacij. Bakterijske celice so se delile vsakih 60 minut.

Preden so nastale hčerinske celice, se je morala DNK v materinskih celicah podvojiti. Podvaja se tako, da se ob stari verigi izdela nova, obe skupaj pa gradita hčerinsko molekulo DNK. Ker je bil kot gradbeni element za novo verigo na voljo le lahki dušik (¹⁴N), je bila DNK 1. generacije po gostoti vmes med težko in lahko. V centrifugirki sta opazila samo en pas, ki je ležal med težko in lahko DNK. S tem sta izključila konzervativno podvajanje, saj bi v tem primeru morala opaziti dva različna pasova, vsekakor pa ne samo en pas "vmesne" DNK. Tudi za nastanek 2. generacije je bil na voljo samo lahki dušik (¹⁴N). V centrifugirki sta opazila dva pasova. Eden je bil na mestu "lahke", drugi pa na mestu "vmesne" DNK. Kako to razložiti? Tokrat sta nastali dve vrsti DNK. Tiste, ki so nastale ob "težki" matrici, so bile po gostoti vmes, tiste pa, ki so nastale ob "lahki" matrici, so bile "lahke". Tako sta ovrgla tudi disperzivno podvajanje, ker bi v 2. generaciji morala dobiti pas, ki ustreza "vmesni" DNK, ki pa bi bil na gradientu nižje od pasu DNK 1. generacije. Pri 3. generaciji se je zgodba ponovila. Le pas lahke DNK je bil širši, kar je pomenilo, da je nastalo še več "lahke" DNK kot v 2. generaciji.

Ugotovitve

Po prvi delitvi je bila vsa DNK vmesne gostote. Hčerinske celice so vsebovale po eno starševsko ("težko") verigo in eno novo nastalo ("lahko") verigo DNK. Po drugi delitvi je bilo 50 odstotkov "vmesne" in 50 odstotkov "lahke"DNK. Komaj polovica celic je vsebovala označene ("težke") molekule DNK - pa še to le eno verigo na celico. Semikonzervativen način podvajanja je tako bil potrjen, hkrati pa tudi struktura DNK, ki sta jo predlagala James D. Watson in Francis Crick (Slika 4)

Viri in literatura

• Brajkovič, B. Genetika.Ljubljana: DZS, 2006
  
• Semiconservative replication. 25.11.2009 [Citirano 27.11.2009] http://en.wikipedia.org/wiki/Semiconservative_replication