Sintezno biološki pristopi v mikrobiologiji

Definicija »življenja«

Raziskovalci si že stoletja prizadevajo oblikovati definicijo življenja. Kljub poznavanju zgradbe celice ne razumemo popolnoma vseh elementov, ki omogočajo življenje organizmov <ref name="ref1">Defining life. Astrobiology Magazine – exploring the solar system and beyond. 19. 6. 2002 [citirano 3. 1. 2016] http://www.astrobio.net/news-exclusive/defining-life/</ref>. Z razvojem »-omik« smo korak bliže k razumevanju življenja, saj omogočajo preučevanje biološke raznovrstnosti organizmov ter interakcij med njimi. Biološke procese organizmov, tudi tistih z majhnimi genomi, težko preučujemo, kaj šele da bi jih dodobra razumeli. S sintezno biologijo ne bi samo lažje razumeli življenja organizmov, temveč bi pridobili tudi znanje kako se boriti proti patogenim organizmom. Prav pri slednjih je namreč ključnega pomena razumevanje izražanje genov ter dejavnikov, ki vplivajo na razvoj virulence <ref name="ref7">Padilla-Vaca, F., Anaya-Velazquez, F. in Franco, B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18:71-81</ref>.

»Branje« DNA

Odkritje strukture DNA je zelo pripomoglo k razumevanju osnov dedovanja. Odkritje botruje razvoju molekularne genetike, s katero je moč preučevati strukturo in funkcijo genov, molekularne osnove razvoja organizmov ter razvoj bolezni, kar pa je navsezadnje pripeljalo do razvoja sodobne biotehnologije in genetskega inženirstva. Strmenje k razumevanju strukture DNA je vodilo k razvoju metod sekvenciranja zaporedij, ki so danes ključno orodje za odkrivanje novih vrst, sledenju evolucije in taksonomske opredelitve. Številne DNA tehnologije, vključno s kloniranjem, verižno reakcijo s polimerazo (PCR), sekvenciranjem, sekvenciranje naslednje generacije (angl. next-generation sequencing, NGS) in nenazadnje sintezna biologija omogočajo poglobljeno preučevanje organizmov <ref name="ref7">Padilla-Vaca, F., Anaya-Velazquez F. in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>. Metode za analizo genomov omogočajo preučevanje strukture genov ter njihovo detekcijo v različnih organizmih. Žal te metode ne omogočajo preučevanja funkcije genov in proteinskih omrežij. Kljub tovrstnim pomanjkljivostim so te temeljna orodja sintezne biologije <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>. Leta 1995 smo dobili zaporedje prvega v celoti sekvenciranega genoma, virusa Haemophilus influenza, ki je pomemben človeški patogen. Nato sta leta 1997 sledili objavi zaporedij genoma dveh ključnih modelnih organizmov, E. coli in S. cerevisiae. Tako danes poznamo zaporedja genomov 58 150 različnih organizmov. Poleg tega imamo v podatkovni bazi GenBank na voljo informacije o ~320 000 opisanih vrstah, v obliki označenih izraženih zaporedij (angl. expressed sequence tags, EST), genomskih zaporedij (angl. genome survey sequences, GSS) in zaporedij, pridobljenih z metodo hitrega pristopa celotnega genoma (angl. whole-genome shotgun sequence, WGS), ki so osnova za študije na modelnih organizmih <ref name="ref2">Growth of GenBank and WGS. The National Center for Biotechnology Information. December 2015 [citirano 3. 1. 2016] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/statistics</ref>. Čeprav pri preučevanju mikroorganizmov v večini še vedno izhajamo iz klasičnih mikrobioloških metod, nam novejše tehnologije, kakršna je metagenomika, omogočajo hkratno identifikacijo različnih mikrobnih populacij znotraj enega vzorca, pa tudi analizo dinamike med njimi. Te metode so pripomogle tudi k hitrejši identifikaciji virulenčnih genov <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>.

Odkrivanje mikrobov z genomiko

Vse boljše poznavanje genomov mikroorganizmov je pripomoglo k boljšemu razumevanju »temne plati« le-teh. Kljub poznavanju genomov patogenih organizmov še vedno težko opredelimo virulenco in z njo povezane gene <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>. Virulenca je pogosto opisana kot stopnja patogenosti posameznega seva znotraj določene mikrobne vrste, vendar pa k virulenci običajno ne pripisujemo tudi dejavnikov, ki omogočajo preživetje gostitelja <ref name="ref4">Virulenca. Terimina. 16. 11. 2015 [citirano 3. 1. 2016] http://www.termania.net/slovarji/mikrobioloski-slovar/6745185/virulenca</ref>. Raziskovalci so pogosto postavljeni pred izziv zlasti takrat, ko pride do širjenja povzročitelja okužbe, ali ko pride do pojava okužbe nove vrste gostitelja (npr. Ebola ali SARS). Z NGS lahko v relativno hitrem času določimo izvor teh smrtonosnih patogenov ter interakcije med patogeni in gostitelji. Uporaba NGS pripomore tako k boljšemu razumevanju nekaterih mehanizmov patogeneze kot tudi razvoja bolezni <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>. Kljub velikemu napredku tudi nove tehnologije spremljajo težave. To so lažno pozitivni rezultati in napačna diagnostika. V izogib tovrstnim težavam NGS zahtevajo delo v zelo čistih pogojih, pa tudi skrbno pripravo reagentov, s čimer se izognemo navzkrižnim kontaminacijam ter zavajajočim rezultatom. Slednji so pogost problem pri vzorcih, katerih količine so izjemno majhne <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>.

Razumevanje genoma

Možnost genetskega sledenja organizmov s preprostimi genomi je bistvenega pomena za hitro razumevanje osnovnih bioloških procesov na ravni sistemov. Bakterije rodu Mycoplasma so prostoživeči celični organizmi z najmanjšimi genomi in so idealni modeli za tovrstna preučevanja. Kljub njihovi majhnosti so genomi sevov divjega tipa še vedno prekompleksni, da bi v celoti razumeli njihove osnovne življenjske procese <ref name="ref9">Suzuki Y, Assad-Garcia N, Kostylev M, Noskov VN, Wise KS, Karas BJ in sod. Bacterial genome reduction using the progressive clustering of deletions via yeast sexual cycling. Genome Research. 2015; 25(3): 435-44</ref>. Nedavno so opisali učinkovito metodo kako zmanjšati genom Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 z delecijo posameznih kodirajočih regij s transpozicijsko mutagenezo in postopnim deletiranjem skupine genomskih segmentov z mejotično rekombinacijo med bakterijskimi genomi vključenimi v celice kvasovk. Tretirane genome so nato prenesli v prejemniške celice, pri čemer so natančneje preučili dva seva Mycoplasma. Prvi sev je vključeval delecijo 91 genov in ~10 % genoma, drugi sev pa je vseboval delecijo sedmih regij od skupaj osmih, kar predstavlja zapise zaporedij 84 genov. Glede na spremembe stopnje rasti so ugotovili interakcije med 91 geni. Kljub napovedanim učinkom delecij na metabolizem sladkorjev, proteom in stopnjo rasti, sprememb ni bilo moč opaziti pri sedmih sevih. Rezultati potrjujejo, da se zmanjšan genom lahko prilagodi glede na manjkajoče gene in omogoči preživetje organizmu. Predvidevajo, da bi bila metoda učinkovita tudi pri reorganizaciji večjih genomov, ki jih še lahko kloniramo v kvasovki, saj slednje olajšajo oblikovanje genomov mikrobov, pa tudi genomskih fragmentov za genetski inženiring višjih evkariontov <ref name="ref9">Suzuki Y, Assad-Garcia N, Kostylev M, Noskov VN, Wise KS, Karas BJ in sod. Bacterial genome reduction using the progressive clustering of deletions via yeast sexual cycling. Genome Research. 2015; 25(3): 435-44</ref>.

»Pisanje« DNA: inženiring bioloških sistemov

Glavni cilj sintezne biologije je oblikovati procese genetsko kodiranih bioloških sistemov, ki bi bili bolj sistematični, predvidljivi, robustni, prilagodljivi in učinkoviti. Glede na vrsto področja se biološki sistemi močno razlikujejo tako po vrsti gostitelja, kot tudi kompleksnosti proteinskih omrežij, ki mnogokrat presegajo preprosta genetska stikala. Kljub velikemu potencialu sinteznih zmogljivosti, načrtovanju poti in genomov, njihova priprava predstavlja velik izziv ravno zaradi pomanjkljivega znanja o nekaterih čisto osnovnih procesih. Sintezna biologija veliko obeta pri reševanju mnogih izzivov s katerimi se danes srečujemo. Ti so tako iz področja proizvodnje, okolja in trajnostnega razvoja, zdravja in medicine, vendar pa je njen potencial omejen na okrnjenost razpoložljivih sistemov in njihovo učinkovitost pri doseganju želenih ciljev, zato si raziskovalci močno prizadevajo premostiti te vrzeli z razvojem novih aplikacij, ki bi jih bilo moč uporabiti tako pri razumevanju bioloških procesov, kot tudi pri uporabi na različnih bioloških sistemih <ref name="ref10">Wang YH, Wei KY in Smolke CD. Synthetic biology: advancing the design of diverse genetic systems. Annual review of chemical and biomolecular engineering, 2013; 4: 69-102</ref>.

Metode za pripravo konstruktov

Hiter razvoj sintezne biologije zahteva možnost sestavljanja večih genov ali operonov v velike fragmente DNA, ki so del metabolnih poti. Dandanes so v uporabi tri tehnike; tehnologija rekombinantne DNA, »BioBrick« in »BgIBrick«. Slednji dve omogočata vnos fragmentov DNA na standardizirana mesta, ki določajo orientacijo. Ker metodi nista primerni za vnos več genov hkrati, so v ta namen razvili metodo »Golden Gate«, ki v eni reakciji omogoča vnos do 9 fragmentov (uspešnost 90 %) <ref name="ref5">Gou YY, Shi ZY, Fu XZ, Chen JC, Wu Q in Chen GQ. A strategy for enhanced circular DNA construction efficiency based on DNA cyclization after microbial transformation. Microbal Cell Factories, 2015; 14(18): 1-13</ref>. Zaradi potrebe po vnosu vse večjih fragmentov »BioBrick«, »BgIBrick« in metoda »Golden Gate« niso primerne. Zato so razvili metode za delo v in vitro pogojih. Ena takšnih je PCR s prekrivajočim podaljškom (angl. Overlap-Extension-PCR, OE-PCR). Gre za rekombinacijo, ki temelji na generiranju enoverižnih previsov. Postopek se običajno uporablja za pripravo fragmentov DNA v velikosti od 0,5 do 5 kb. Izboljšave opisane metode so »In-Fusion«, SLIC in Gibson. Vse tri metode uporabljajo komercialne encimske mešanice za sestavljanje fragmentov s 15 bp prekrivajočim se zaporedjem <ref name="ref5">Gou YY, Shi ZY, Fu XZ, Chen JC, Wu Q in Chen GQ. A strategy for enhanced circular DNA construction efficiency based on DNA cyclization after microbial transformation. Microbal Cell Factories, 2015; 14(18): 1-13.</ref>. Kloniranje z USER (angl. uracil-specific excision reagent) je metoda za delo s PCR, ki sprva uvede vsaj en uracil, nato sledi izrez uracila z uracil DNA-glikozilazo. Nastane mesto, ki ga specifično cepi liaza-AP, pri čemer običajno nastane 30 previsov, ki se prilegajo s komplementarnimi previsi fragmenta s prekrivajočim se zaporedjem <ref name="ref5">Gou YY, Shi ZY, Fu XZ, Chen JC, Wu Q in Chen GQ. A strategy for enhanced circular DNA construction efficiency based on DNA cyclization after microbial transformation. Microbal Cell Factories, 2015; 14(18): 1-13.</ref>. Metodo za delo v in vivo pogojih so razvili na inštitutu J. C. Venter-ja. Metoda temelji na izkoriščanju homologne rekombinacije kvasovk. To so uporabili pri sestavljanju sintetičnega genoma Mycoplasma genitalium. Kvasovke za sestavljanje genomov niso vedno najboljša izbira. Poročajo o uspešnem sestavljanju genoma v bakteriji B. subtilis, kjer so sestavili 3500 kb velik genom cianobakterije rodu Synechocystis <ref name="ref5">Gou YY, Shi ZY, Fu XZ, Chen JC, Wu Q in Chen GQ. A strategy for enhanced circular DNA construction efficiency based on DNA cyclization after microbial transformation. Microbal Cell Factories, 2015; 14(18): 1-13</ref>. Kljub prizadevanju za izboljšanje ligacije in učinkovitosti in vitro rekombinacije pogosto spregledamo dve protislovji pri pripravi krožnih konstruktov. Prvo protislovje je, da pri ligaciji fragmentov potrebujemo višje koncentraciji DNA fragmentov, medtem ko je ciklizacija uspešnejša pri nižjih koncentracijah DNA. Drugo protislovje pa je, da je transformacija ligiranih produktov uspešnejša, če imamo visoke koncentracije DNA <ref name="ref5">Gou YY, Shi ZY, Fu XZ, Chen JC, Wu Q in Chen GQ. A strategy for enhanced circular DNA construction efficiency based on DNA cyclization after microbial transformation. Microbal Cell Factories, 2015; 14(18): 1-13</ref>. Aplikacije v mikrobiologiji Glede na poročilo Svetovne zdravstvene organizacije iz leta 2014 največjo skrb povzroča odpornost Gram-negativnih bakterij na antibiotike. Ker ~99 % bakterij ne znamo gojiti v laboratorijih, so razvili visoko-zmogljivo napravo iChip ali »Isolation chip«, s katero bakterijo izoliramo, vendar jo gojimo pri pogojih, ki posnemajo naravno okolje <ref name="ref3">Coppola S. How the iChip Works. Northeastern Magazine. 2015 [citirano 30.12.2015] http://www.northeastern.edu/magazine/how-the-ichip-works/</ref>. Z uporabo te naprave so odkrili nov antibiotik (teixobacin), na katerega ni bilo opaziti rezistence. S kombinacijo NGS in sintezne biologije si prizadevajo, da bi lahko pod laboratorijskimi pogoji pripravili takšne sintezne organizme, ki bi lahko sintetizirali želene spojine <ref name="ref8">Piddock LJV. Teixobactin, the first of a new class of antibiotics discovered by iChip technology? The Journal of antimicrobal chemotherapy, 2015; 70(10): 2679-80</ref>. Iz leta v leto poročajo o vse več epidemijah; npr. virus Ebola, SARS. Tradicionalni postopek priprave cepiv je star desetletja in zahteva veliko časa. S sintezno biologijo bi se lahko izognili tovrstnim težavam tako, da bi sintetizirali nekaj epitopov iz znanega zaporedja genoma virusa in preverili njihovo učinkovitost v obliki cepiva <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>. Tehnologijo bi lahko uporabili pri pripravi celotnih virusnih delcev ali številnih antigenskih proteinov iz patogenov z višjo vsebnostjo G+C, kar je v laboratoriju težje doseči. S sintezno biološkimi sistemi bi lahko pospešili razvoj in pripravo tako biofarmacevtikov, kot tudi tradicionalnih antibiotikov, pri čemer bi bili končni produkti enaki, le način priprave bi se razlikoval od današnjega. Sintezna biologija torej ni uporabna samo za izboljšanje donosov naravnih produktov, ampak tudi za povečanje spektra kemijskih struktur, kar bi pripomoglo k ustvarjanju novih aktivnih analogov <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>.

Potencialna zloraba sintezne biologije

Tako kot z razvojem vsake nove tehnologije, se tudi na področju sintezne biologije pojavlja bojazen glede razvoja organizmov, ki bi lahko škodovali tako ljudem kot okolju. Da bi preprečili morebitno katastrofo, se vse več pozornosti posveča preventivi kako preprečiti nenamerno sproščanje genetsko spremenjenih organizmov v okolje <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>. Obstoječe varovalne metode ne zadoščajo zaradi močno ohranjenih evolucijskih mehanizmov; spontana mutageneza in horizontalni prenos genov. Primer je gensko spremenjena E. coli s spremenjenim genskim kodom, ki je odvisna od metabolizma nestandardnih aminokislin <ref name="ref6">Mandel DJ, Lajoie MJ, Mee MT, Takeuchi R, Kuznetsov G, Norville JE in sod. Biocontainment of genetically modified organisms by synthetic protein design. Nature, 2015; 518(7537): 55-60</ref>. Kljub bojazni razvoja bioloških orožij se zdi, da imajo sintezno biološke tehnike večji pomen pri razumevanju bioloških procesov kot pri pripravi bioloških orožij <ref name="ref7">Padilla-Vaca F, Anaya-Velazquez F in Franco B. Synthetic biology: Novel approaches for microbiology. International Microbiology, 2015; 18: 71-81</ref>.

Viri in literatura

<references/>