Trans-translacija

Trans-translacija (tmRNA-SmpB kompleks)

Translacija mRNA v proteine je bistvenega pomena za preživetje vsake celice. Napake in poškodbe pri translaciji so za celice lahko usodne, zato so bakterije vseh tipov razvile poseben mehanizem za njihovo preprečevanje. Pri teh poteče translacija po mehanizmu imenovanem trans-translacija. Za njeno delovanje sta ključni dve strukturi, transfer-messenger RNA (tmRNA) in small protein B (SmpB). Do trans-translacije pride, če ribosom zastane na 3'-koncu mRNA, ki ne vsebuje stop-kodona, na katerem bi sicer potekla terminacija translacije ter razpad kompleksa ribosom-mRNA. tmRNA je bila v literaturi prvič opisana leta 1979 (Ray, Apirion) na podlagi raziskav Escherichie coli in takrat poimenovana kot 10S RNA molekula. Kljub odkritju temu je bila njena biološka vloga razjasnjena šele leta 1996, ko so ugotovili, da je vpletena v označevanje peptidov, ki nastanejo pri translaciji poškodovane mRNA ter posledično v njihovo razgradnjo. Presenetljivo je hibridna tmRNA strukturno zgrajena iz delov značilnih tako za tRNA, kot tudi mRNA.

Struktura tmRNA

Strukturno lahko molekulo razdelimo na dva glavna značilna dela, tRNA (tRNA-like domain – TLD) ter mRNA (mRNA-like domain – MLD) aktivno domeno. Sestavljena je še iz psevdovozlov (pseudoknots – PK), H2 heliksa ter ohranjenega H5 heliksa, ki vsebuje terminacijski stop-kodon. Celotno zaporedje je običajno dolgo nekje med 230 in 400 nukleotidov.

→ tRNA domena

Interakcija med 5' in 3' koncem zrele tmRNA tvori akceptorsko mesto, ki je kot pri običajni tRNA podaljšano na 3'-koncu, na katerega je v tem primeru vedno aminoaciliran alanin. Vsebuje še T-zanko in reducirano D-zanko, medtem ko antikodona nima. T-zanka vsebuje dve post-transkripcijsko modificirani aminokislini – 5'-metiluridin in psevdouridin.

→ mRNA domena

Ključnega pomena je tu kratko ORF zaporedje, ki vsebuje stop-kodon, in po translaciji služi kot signalno zaporedje, ki ga takoj prepoznajo proteaze. Običajno je sestavljen iz 10 ohranjenih aminokislinskih ostankov (AANDENYALAA) ter začetnega alanina, ki ga nosi TLD domena. Zanimivo pri tem pa je, da ne vsebuje AUG (Met) iniciacijskega kodona, kot tudi ne Shine-Dalgarno zaporedja. Po translaciji je, s tem zaporedjem označen protein, tarča proteaz, ki ga nemudoma razgradijo.

→ Prstan s psevdovozli (PK)

Večinoma ima tmRNA štiri PK, vendar število variira, in ne igra posebno pomembne vloge pri samem označevanju proteinov. PK1 se nahaja pred, PK2-4 pa za MLD domeno (gledano od 5' proti 3' koncu). Pri tem je nujen le PK1, ki stabilizira regijo med TLD in MLD in omogoča pravilno zvitje tmRNA. Primarna vloga ostalih PK je formacija zrele in pravilno zvite tmRNA, in ne sama trans-translacijska aktivnost. Naj bo tmRNA še tako dobro strukturno oblikovana, je povsem odveč, če pri procesu ni prisoten še majnen protein B (SmpB), s katerim tvori aktiven kompleks.

Struktura SmpB

V Escherichii coli gre za 160 aminokislinski protein kodiran na smpb genu, ki je bistven za učinkovito trans-translacijo. Primarno zaporedje je visoko ohranjeno, delecija tega gena pa se po raziskavah odraža kot odsotnost tmRNA v celici. Za strukturo proteina je značilna zmožnost vezave na oligonukleotid, sestavljena je iz šestih β-trakov, obkroženih s tremi α-heliksi. Pomembni sta še dve izpostavljeni RNA-vezavni domeni. V kompleksu s tmRNA se SmpB nahaja na mestu, kjer bi bila sicer antikodon in D-zanka tRNA. SmpB ima poleg omenjenih sekundarnih struktur se C-teminalni rep, ki v ribosomu tvori α-heliks. Funkcijsko je pomemben za sàmo tmRNA označevanje, poleg tega je bilo nedavno dokazano, da se veže v A-mesto 30S podenote ribosoma. Presenetljivo pa najbolj ohranjen ni končni α-heliks, temveč regija pred njim, ki zagotavlja fleksibilnost in deloma zagotavlja pravilno izbiro kodona.

Cikel trans-transformacije

Zorenje tmRNA in nastanek kompleksa

(1) 5'-konec primernega transkripta tmRNA procesira endonukleaza RNAza P. 3'-konec najprej cepi endonukleaza RNAza III ali RNAza E, nato pa ga reže še eksonukleaza RNAza T in/ali RNAza PH. Modificirani so tudi nukleotidi v T-zavoju – TrmA katalizira 5-metiluridin, TruB pa psevdouridin.

(2) Nastane kompleks tmRNA-SmpB.

(3) S pomočjo Ala-RS poteke alanilacija tmRNA.

(4) Ala-RS se sprosti.

(5) EF-Tu·GTP in S1 se vežeta na Ala-tmRNA^Ala-SmpB. Kompleks je zdaj pripravljen, da reši zastali ribosom.

Re-registracija

(6) Kompleks Ala-tmRNA^Ala-SmpB-EF-Tu•GTP se veže na zastali ribosom. SmpB prepozna nezasedeno mesto A, S1 pa se sprosti.

(7) SmpB posnema prepoznavo kodon-antikodon in inducira GTPazno aktivnost EF-Tu. Ala-tmRNA^Ala-SmpB se namesti na mesto A, deacil tRNA z mesta E in EF-Tu•GDP pa se sprostita.

(8) Poteče peptidilni prenos. Nastajajoči peptid se iz mesta P prenese na Ala-tmRNA^Ala in se podaljša za 1 alanin.

(9) Podenota ribosoma 30S se spontano zavrti v nasprotni smeri urinega kazalca glede na podenoto 50S v gibu podobnem mehanizmu raglje. Le ta privede do hibridnih vezav TLD-SmpB na mesti A/P in tRNA na mesti P/E.

(10) EF-G•GTP se veže na ribosom, stabilizira formacijo raglje in vnese poseben nagib 12°.

(11) Poteče hidroliza GTP. TLD-SmpB se translocira na mesto P, tRNA pa na mesto E. Notranji ORF na tmRNA se nahaja na mestu A.

(12) EF-G•GDP in mRNA brez stop kodona se sprostita, slednjo nato razgradi RNAza R.

Elongacija (ponovni zagon translacije na notranjem ORF tmRNA)

(13) Na ribosom se veže kompleks aa-tRNAaa-EF-Tu•GDP.

(14) Hidroliza GTP se inducira s prepoznavo notranjega ORF tmRNA s tRNA. Na mesto A se namesti aa-tRNAaa. EF-Tu•GDP in deacil tRNA z mesta E se sprostita.

(15) Poteče peptidilni prenos, podobno kot pri (8).

(16) Raglja (9).

(17) Vezava EF-G•GTP kot pri (10).

(18) Hidroliza GTP, translokacija kot pri (11).

(19) Sprostitev EF-G•GDP. Proces elongacije se ponavlja do stop kodona.

Terminacija

(20) Translacija doseže tmRNA stop kodon.

(21) Sprostitveni dejavnik tipa I prepozna stop kodon in se veže na mesto A.

(22) Vezani faktor sproži tRNA deacetilacijo na mestu P. Novonastali peptid ali protein z oznako tmRNA se sprosti. Proteaze oznako prepoznajo in razgradijo potencialno nevarni produkt.

(23) Sprostitveni dejavnik tipa II se veže na ribosom.

(24) Hidroliza GTP inducira raglji podoben premik in hitro disociacije sprostitvenih dejavnikov.

(25) Vezava RRF in EF-G•GTP.

(26) Hidroliza GTP. RRF deluje kot klin ter povzroči disociacijo in ponovno uporabo velike ribosomalne podenote.

(27) Deacil tmRNA in tRNA disociirata z male ribosomalne enote, ki lahko sodeluje pri novem ciklu translacij. Kompleks tmRNA-SmpB se lahko ponovno uporabi.

Proteini, ki sodelujejo pri procesu trans-translacije

Poleg SmpB so za pravilen potek trans-translacije pomembni tudi drugi proteini:

• procesirajoči encimi,

• encimi, ki katalizirajo posttranskripcijske modifikacije,

• alanil-tRNA sintetaza,

• EF-Tu,

• S1 in

• RNAza R.

Od vseh naštetih proteinov se vsi razen proteina S1 vežejo na tRNA podobno domeno tmRNA, protein S1 pa se združuje s prstanom s psevdovozelno regijo tmRNA.

Procesirajoči encimi

Gen ssrA, ki kodira zapis za tmRNA, vsebuje zapis za prekurzorsko molekulo tmRNA, dolgo 457 nukleotidov v bakterijah Escherichia coli, ki se mora sprva cepiti pred začetkom delovanja. Na 5'-koncu verige prekurzorsko molekulo cepi endonukleaza RNAza P, 3'-konec pa cepijo ali endonukleza RNAza III ali RNAza E, nato pa še dodatno eksonukleazi RNAza T ali RNAza PH, v nekaterih primerih pa tudi obe. Delovanje procesirajočih encimov privede do 363 nukleotidov dolge zrele molekule tmRNA s konzervativnim zaporedjem na 3'-koncu (CCA).

Posttranslacijske modifikacije

V TLD tmRNA sta, kot v molekulah tRNA, prisotna tudi 5-metiluridin in psevdouridin. Za C5-metilacijo uridina je pri tmRNA odgovoren le encim TrmA, kljub večjemu številu drugih metiltransferaz. Pri Gram pozitivnih bakterijah, ki nimajo proteina TrmA, je za ta proces odgovoren encim TrmFO, ki je odvisen od metilen-tetrahidrofolata. Psevdouridilacija poteče s pomočjo tRNA Ψ55 sintaze oziroma krajše TruB.

Alanil-tRNA sintetaza

Alanil-tRNA sintetaza oziroma krajše AlaRS je encim, ki vzporedno z razgradnjo ATP v AMP in pirofosfat povzroči vezavo alanina na tmRNA na konzervativnem zaporedju na 3'-koncu molekule, nastane L-alanil-tmRNA. Molekula tmRNA ima G3•U357 bazni par, ki je identičen baznemu paru G3•U70 (številke označujejo pozicijo v molekuli) v tRNA^Ala, kar je razlog za delovanje AlaRS na tmRNA.

Elongacijski faktor EF-Tu

EF-Tu z vezanim GTP se veže na kompleks tmRNA-SmpB ter povzroči začetek trans-translacijskega razreševanja zaustavljenega ribosoma. GTP se nato hidrolizira in EF-Tu oddisociira od kompleksa tmRNA-SmpB-ribosom.

Protein S1

Protein S1 se veže tudi na tRNA, vendar se v večji meri (600-krat več) veže na tmRNA. Veže se na psevdovozelno regijo tmRNA in olajša dostop do odprtega bralnega okvira v mRNA podobni domeni. Pirazinamid, zdravilo za tuberkulozo, se veže na protein S1 in inhibira proces trans-translacije.

RNAza R

Omenjena eksoribonukleaza pri procesu trans-translacije razgrajuje mRNA molekule, ki so privedle do zastajanja ribosoma. Poleg tega se tmRNA-SmpB veže na C-končno domeno RNAze R, s tem pa je šele omogočeno delovanje tmRNA-SmpB na območju zaustavljenih ribosomov.

Zdravljenje bolezni

Veliko število proteinov, ki so potrebni za proces trans-translacije nam nudi tudi veliko število potencialnih in tudi že obstoječih tarč za zdravila, ki bi preprečila ali zaustavila trans-translacijo, kot je že razvidno iz primera zdravljenja tuberkuloze s preprečevanjem reševanja zaustavljenih ribosomov pri povzročitelju tuberkuloze, bakteriji Mycobacterium tuberculosis. Druga zdravila bi lahko uspešno inhibirala potek drugih bakterijskih infekcij.