Procesiranje celičnih informacij s sintetičnimi RNA napravami

Higher-Order Cellular Information Processing with Synthetic RNA Devices [1]

Inženirstvo je široka disciplina, ki zajema številne panoge med katerimi je v zadnjih nekaj letih vedno več pozornosti namenjeno biološkim sistemom. Sposobnost bioloških sistemov prenosa informacij med živimi sistemi in znotraj njih, v kombinaciji z inženirskim pristopom nudi nove načine regulacije izražanja genov in s tem povezanih potencialnih možnosti zdravljenja. Pri tem imajo ključno vlogo proteini, ki v različnih kombinacijah lahko tvorijo nekakšna biološka vezja, odgovorna za procesiranje specifične informacije. Vzporedno s proteini pa podobno funkcijo prevzemajo tudi sintetične RNA naprave.

Sintetične RNA naprave

Podobno kot proteini lahko tudi sintetične RNA naprave pretvarjajo vhodne informacije v izhodne signale. V celičnih sistemih vhodne informacije navadno predstavljajo endogene ali eksogene signalne molekule, ki lahko tvorijo interakcije z RNA napravo, ta pa glede na tip signalne molekule izvrši ustrezno funkcijo. Običajno sproži ali pa zavre translacijo in posledično produkcijo izhodnega signala oziroma tarčnega proteina. Glede na funkcijo delimo sintetične RNA naprave na različna logična vrata (IN, NE-ALI, NE-IN ali ALI), filtre signalov, ojačevalce signalov in logična vrata, ki izkazujejo kooperativnost [1].

Enostavnost modeliranja, visoka kompatibilnost in široke možnosti aplikacij RNA naprav so znanstvenike kalifornijskega inštituta za tehnologijo gnale k osnovanju splošnega ogrodja za pripravo sintetičnih RNA naprav z različnimi funkcijami in številom vhodnih signalov. Tako pripravljene RNA naprave so vsebovale tri osnovne, funkcionalno različne gradnike: RNA aptamer s funkcijo senzorja, ribocim v obliki kladiva s katalitično funkcijo, in RNA vmesnik, ki vsebuje tekmovalno in preklopno verigo [1]. RNA vmesnik igra zelo pomembno vlogo, saj povezuje RNA aptamer in ribocim, hkrati pa z lastno strukturo, ki jo pogojuje hibridizacijski vzorec tekmovalne in preklopne verige, določa aktivnost ribocima pred vezavo vhodne molekule. Če je ribocim pred vezavo vhodne molekule v aktivni obliki, pravimo taki napravi RNA naprava ON. V nasprotnem primeru govorimo o RNA napravi OFF [2].

Sestavljene komponente se nato lahko preko regije ribocima vežejo na 3' UTR konec transkripta specifičnega gena. Po vezavi vhodne molekule v vezavni žep RNA aptamera pride do konformacijskih sprememb tekmovalne in preklopne verige RNA vmesnika in s tem aktivacije ali inhibicije ribocima. Aktiviran ribocim katalizira cepitev mRNA tarčnega gena, kar privede do nastanka nefunkcionalnega transkripta in s tem zavrte translacije [1].

S pomočjo zgoraj opisanega splošnega ogrodja in izbire začetne konformacije ribocima je mogoče sestaviti kompleksnejše sintetične RNA naprave z več kot enim vhodnim signalom. Ena izmed takih naprav je RNA naprava SI 1, ki vsebuje dva ločena ribocima, vezana v dve regiji 3' UTR konca tarčnega gena, vsak izmed njiju pa ima vezano senzorično komponento (RNA aptamer). RNA naprava SI 1 omogoča torej vgradnjo dveh različnih začetnih konformacij ribocima (RNA naprava ON ali OFF), pod kontrolo dveh enakih ali različnih vhodnih signalnih molekul. RNA napravi SI 2 in SI 3 pa sta sestavljeni iz enega ribocima, vezanega v 3' UTR konec tarčnega gena, nanj pa sta pripeti dve senzorični komponenti. Slednji sta lahko preko RNA vmesnika vezani vzporedno (na oba konca ribocima) ali zaporedno (ena na drugo). RNA napravi SI 2 in SI 3 tako omogočata vgradnjo ene začetne konformacije ribocima pod kontrolo dveh različnih ali enakih vhodnih molekul na dva različna načina [1].

Sintetične RNA naprave s funkcijo logičnih vrat

Za izgradnjo sintetičnih RNA naprav je bil pripravljen univerzalni vektor pRzS z reporterskim rumenim fluorescirajočim proteinom (yEGFP) pod kontrolo močnega inducibilnega promotorja GAL1-10. Vse DNA matrice RNA gradnikov so bile pripravljene z metodo PCR in vstavljene v 3' UTR regijo reporterskega proteina preko ustreznih restrikcijskih mest. Na ta način so bila pripravljena logična vrata IN, NE-ALI, NE-IN in ALI, njihova ustreznost pa je bila testirana v posebnem sevu Saccharomyces cerevisiae [3].

Logična vrata IN

Sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat IN je bila pripravljena po principu RNA naprave SI 1. Pri tem sta bila oba ribocima pred vezavo vhodne molekule v aktivni konformaciji (RNA naprava ON), senzorski komponenti pa sta omogočali vezavo dveh različnih vhodnih molekul, teofilina in tetraciklina. Ob vezavi specifične vhodne molekule pride do inaktivacije ustreznega ribocima. Ker je za cepitev in inaktivacijo transkripta tarčnega gena potreben le en aktivni ribocim, je do visoke proizvodnje yEGFP je prišlo le v primeru inaktivacije obeh ribocimov, torej ob vezavi obeh vhodnih molekul [1].

Logična vrata NE-ALI

Na enak način so kot logična vrata IN je bila narejena tudi sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat NE-ALI. Razlika je le v tem, da slednja vsebujejo oba ribocima pred vezavo v neaktivni konformaciji (RNA naprava OFF). To pomeni, da je proizvodnja yEGFP visoka le v primeru odsotnosti obeh vhodnih molekul [1].

Logična vrata NE-IN

Sintetična RNA naprava s funkcijo logičnih vrat NE-IN je bila pripravljena po principu RNA naprave SI 2. Pri tem je bil ribocim pred vezavo vhodne molekule v neaktivni konformaciji (RNA naprava OFF), senzorski komponenti, vezani vzporedno preko dveh RNA vmesnikov na levo in desno zanko ribocima, pa sta omogočali vezavo dveh različnih vhodnih molekul, teofilina in tetraciklina. Do aktivacije ribocima pride le v primeru vezave obeh vhodnih molekul. To pomeni, da je v odsotnosti obeh vhodnih molekul oziroma vezave le ene izmed vhodnih molekul proizvodnja yEGFP vseskozi visoka, ob vezavi obeh vhodnih molekul pa je translacija popolnoma zavrta [1].

Kooperativnost vezave in logična vrata

Kooperativnost vezave je pojav med dvema zvrstema biološki molekul. Ena izmed zvrsti molekul vsebuje več vezavnih mest v katera se lahko veže molekula druge zvrsti. Pri tem nezasedena vezavna mesta z nizko afiniteto ob vezavi posamezne molekule v vezavno mesto, preidejo v stanje z visoko afiniteto. Več vezavnih mest kot je zasedenih, višja je efektivna afiniteta nezasedenega vezavnega mesta do naslednje molekule [4].

Danes poznamo več različnih teoretičnih modelov, ki bolj ali manj dobro opisujejo dejanska stanja molekul tekom kooperativne vezave. Najstarejši izmed njih je tudi Hillov model oziroma Hillova enačba, ki je bila osnovana na primeru kooperativne vezave kisika na hemoglobin. S pomočjo te in pa ustreznih eksperimentalnih kinetičnih parametrov lahko za specifično vezavo izračunamo Hillov koeficient (n), ki pove stopnjo in vrsto kooperativnosti. Če je Hillov koeficient večji od ena imamo opravka s pozitivno kooperativno vezavo (n > 1). V primeru negativne kooperativne vezave je Hillov koeficient manjši od ena (n < 1). Če pa je Hillov koeficient enak ena, potem dotična vezava ni kooperativna (n = 1). To pomeni, da so vezavna mesta neodvisna drug od drugega, ne glede na to ali so zasedena ali prosta [1,4].

Z zgornjim dejstvom v mislih so bila po principu RNA naprave SI 3 ustvarjena logična vrata IN, ki izkazujejo kooperativnost. Slednja so podobna logičnim vratom NE-IN. Razlika je v ribocimu, ki je v tem primeru pred vezavo vhodnih molekul v aktivni obliki (RNA naprava ON). Poleg tega pa sta senzorski komponenti vezani zaporedno, ena na drugo. Prva senzorična komponenta povezuje ribocim in zadnjo senzorično komponento preko dveh RNA vmesnikov. Pri tem stanje zadnje senzorske komponente regulira stanje prve senzorske komponente, RNA vmesnik med njima pa določa energijsko oviro med posameznimi stanji (pred vezavo, po vezavi ene in po vezavi dveh vhodnih molekul). Tako kot pri klasičnih je tudi pri teh logičnih vratih IN produkcija yEGFP visoka le v primeru vezave obeh vhodnih molekul (teofilina in tetraciklina) [1].

Poleg logičnih vrat IN pa kooperativnost izkazujejo tudi logična vrata, ki vsebujejo aktiven ribocim pred vezavo vhodne molekule (RNA naprava ON) in imajo dve zaporedno vezani senzorični komponenti, ki lahko vežeta dve enaki vhodni molekuli teofilina. Senzorični komponenti povezuje RNA vmesnik, katerega struktura daje večjo afiniteto do vhodne molekule zadnji senzorični komponenti. Posledično se prva molekula teofilina veže na zadnjo senzorično komponento, kar privede do povečanja efektivne afinitete v prvi senzorični komponenti, to pa olajša vezavo druge molekule teofilina. Ob vezavi obeh molekul pride do inaktivacije ribocima in visoko proizvodnjo yEGFP. Z modificiranjem posameznih senzoričnih komponent in RNA vmesnika lahko spreminjamo stopnjo kooperativnosti. Na tak način je bila pripravljena sintetična RNA naprava s pozitivno kooperativnostjo in Hillovim koeficientom, ki je znašal 1,65 [1].

Zaključek

Sintetične RNA naprave v zadnjih letih postajajo odmevno orodje sintezne biologije. Za pripravo poljubnih sintetičnih RNA naprav je bila osnovana univerzalna metodologija in načini sestavljanja treh osnovnih gradnikov. Sodobne RNA naprave imajo lahko funkcijo logičnih vrat (IN, NE-ALI, NE-IN ali ALI), filtriranja signalov in logičnih vrat z kooperativno vezavo vhodnih molekul. Vpliv sintetične RNA naprave na tarčni gen določajo 3 kontrolne točke. Z izbiro promotorja pod katerim je RNA naprava zapisana na plazmidu uravnavamo nivo njenega izražanja in s tem tudi izražanje tarčnega proteina. S spreminjanjem RNA vmesnika, ki povezuje ribocim, in senzorično komponento, določamo konformacijo ribocima pred vezavo vhodne molekule (RNA naprava ON ali OFF). S spreminjanjem senzoričnih komponent ter RNA vmesnika, ki povezuje zaporedno vezani senzorični komponenti pa določamo kooperativnost vezave. Širok nabor funkcij, potencialne aplikacije in nastanek patenta nakazujejo na zanimivo prihodnost sintetičnih RNA naprav.

Literatura

[1] M. N. Win in C. D. Smolke. “Higher-order cellular information processing with synthetic RNA devices.” Science 2008, 322, 456-460.

[2] M.N. Win in C.D. Smolke. “A modular and extensible RNA-based gene regulatory platform for engineering cellular function.” PNAS 2007, 104, 14283-14288.

[3] M. N. Win in C. D. Smolke. “Higher-order cellular information processing with synthetic RNA devices.” Science 2008, dodatno gradivo.

[4] M.N. Win in C.D. Smolke. The Metabolic Pathway Engineering Handbook: Regulating Gene Expression through Engineered RNA Technologies. London, New York: Taylor and Francis group 2009, str. 8-1-8-13.