ASTARice – biosinteza astaksantina v rižu

aSTARice biosynthesizes astaxanthin in rice - South China Agricultural University

Projekt aSTARice je pripravila skupina SCAU-China, ki se je osredotočila na možnost biosinteze astaksantina v rižu. Astaksantin je naravni keto-kartenoid, ki daje značilno rdeče obarvanje nekateri mikroalgam, kozicam in lososu. Ti organizmi ne sintetizirajo astaksantina, ampak ga pridobijo s hrano. Biosinteze so sposobne le določene zelene alge (Haematococcus pluvialis) in rdeče kvasovke (Phaffia rhodozyma), zato trenutno na trgu prevladuje sintetično pridobljen astaksantin, ki ga je precej težko primerno očistiti za morebitno uporabo kot prehransko dopolnilo. Dodatno čiščenje otežuje tudi njegova topnost, saj je netopen v vodi in topen v organskih topilih, ki so večinoma neprimerna za morebitno uporabo v prehrani. S tržnega vidika je zato možnost biosinteze zelo zanimiva, saj astaksantin deluje kot antioksidant in naj bi preprečeval kardiovaskularne bolezni, okužbe s Helycobacter pylori, nastanek katarakte ter izboljšal imunski sistem.

Biosintetska pot

Biosintetska pot astaksantina poteka preko zeaksantina, ki ga lahko sintetizirajo nekatere višje rastline kot na primer koruza. Nadaljnja pretvorba do astaksantina pa zahteva encim β-karoten ketolazo, ki ni prisoten v teh rastlinah. Za sam projekt niso izbrali koruze ampak riž, pri katerem bi za celotno pretvorbo od piruvata do astaksantna potrebovali več kot deset različnih encimov. Na osnovi poskusov s katerimi so pripravili Zlati riž, so ugotovili, da so ključni štirje encimi. Pri tem so se osredotočili na sintezo v endospermu riža. Ključni encimi so:

• fitoen sintaza (gen PSY), ki so jo pridobili iz koruze (Zea mays), katalizira pretvorbo geranilgeranil pirofosfata v fitoen;
• fitoen desaturaza (gen CrtI), ki so jo pridobili iz bakterije Erwinia uredovora, zaključi katalitični process pretvorbe fitoena v likopen;
• β-karoten hidroksilaza (gen BHY), ki so jo pridobili iz zelene alge Haematococcus pluvialis, katalizira pretvorbo β-karotena v zeaksantin;
• β-karoten ketolaza (gen BKT), ki so jo pridobili iz zelene alge Chlamydomonas reinhardtii, pa katalizira končno pretvorbo zeaksantina v astaksantin.

Poleg tega je v endospermu riža že naravno prisoten encim β-likopen ciklaza (gen β-LCY), ki omogoča sintezo β-karotena, če sta prisotna tudi gena PSY in CrtI. Ta encim torej katalizira vmesni korak med likopenom in β-karotenom. V endospermu riža je naravno prisoten tudi gen BHY, vendar se praktično ne izraža, zato so v okviru projekta vnesli tudi gen BHY.

Izbira bioreaktorja

Za projekt so izbrali riž (Oryza sativa) kot bioreaktor, ker ima mnoge prednosti pred ostalimi višjimi rastlinami. Riž je kmetijska rastlina, ki omogoča cenovno ugodno gojenje, ima velik donos in velja za zelo varno rastlino s stališča genskega spreminjanja. Poleg tege je njegov endosperm primerna oblika biomase za shranjevanje astaksantina, saj njegovo nalaganje v semenih ne moti rasti celotne rastline. Za riž so se odločili tudi zato, ker so se pri pripravi lahko opirali na raziskave, ki jih je izvedla skupina dr. Potrykuse, ko so pripravljali riž z večjo vsebnostjo β-karotena.

Priprava ustreznega vektorja

Na začetku projekta so pri vseh izbranih genih izvedli optimizacijo kodona in nato so zaporedja pripravili z direktno sintezo. Pripravljene zapise so vnesli v ustrezne ekspresijske kasete, ki omogočajo specifično izražanje le v endospermu, pri čemer so za vsak zapis uporabili drugačen tkivno specifičen promotor. Te kasete so vstavili v oba donorska vektorja (pYL332-d1 in pYL332-d2), ki so ju nato uporabili za pripravo končnega vektorja, ki je poleg vseh štirih kaset vseboval še selekcijski marker. Za sestavljanje vektorja so uporabili sistem “TransGene Stacking II”, ki temelji na uporabi akceptorskega TAC-vektorja (pYLTAC380GW) in dveh donorskih vektorjev. TAC-vektor je umetno pripravljen in transformacijsko kompetenten ter po zasnovi temelji na strukturi kromosomov. Za vnos različnih genov v ta vektor se uporablja rekombinacijski sistem Cre/loxP, pri čemer sta dva para mest loxP mutirana. Mutirana para sta prisotna na donorskih vektorjih, zaradi česar poteče ireverzibilna rekombinacija s katero se izbrana kaseta vnese v TAC-vektor. Vnos vseh štirih kaset poteče v več ciklih z alternirajočo uporabo obeh donorskih vektorjev. V vsakem cilku se vnese ena ekspresijska kaseta, ki vsebuje zapis za izbran encim pod ustreznim tkivno specifičnim promotorjem. Po vnosu vseh štirih ekspresijskih kaset so s klonirnim sistemom “Gateway” med dve loxP mesti vnesli še ekspresijsko kaseto za higromicin fosfotransferazo (gen HPT), ki omogoča rezistenco na antibiotik higromicin in služi kot selekcijski marker, ter inducibilno ekspresijsko kaseto za gen cre. Gen cre so vnesli pod kontrolo promotorja, ki je specifičen za prašnice, kar je pri nadaljnjem delu omogočilo izbris selekcijskega markerja. Končno obliko vektorja so imenovali pYLTAC380MF-BBPC pri čemer MF označuje, da je končna transgena rastlina “marker-free”, črke BBPC pa označujejo vse štiri ekspresijske kasete za sintezo ustreznih encimov.

Preverjanje uspešnosti kloniranja

Uspešnost priprave vektorja so preverili z restrikcijsko analizo, saj so vsako kaseto vstavili med dve restrikcijski mesti za restriktazo NotI. Tako so omogočili, da se pri restrikcijski analizi izreže celotna ekspresijska kaseta, saj se vse štiri kasete razlikujejo po velikosti. Test so opravili na vsaki stopnji priprave in tako preverili vnos vsake kasete posebej. Preko NotI restrikcijskih mest so lahko izrezali tudi ekspresijsko kaseto za higromicin fosfotransferazo in tako preverili ali so uspešno vstavili tudi selekcijski marker. Opravljeni poskusi so pokazali, da so uspešno pripravili ustrezni vektor.

Priprava transgenega riža

S pripravljenim vektorjem, ki je vseboval vse zapise in selekcijski marker so z elektroporacijo transformirali sev EHA105 bakterije Agrobacterium tumefaciens in jo uporabili za okužbo riževega kalusa. Pripravili so kokulturo transformirane bakterije in riževega kalusa ter izvedli selekcijo v prisotnosti higromicina, saj so bili nanj odporni le okuženi kalusi. Z ustreznim medijem so nato povzročili diferenciacijo okuženih kalusov in gojenje nadaljevali v rastlinjaku. Dobili so prvo generacijo transgenega riža pri kateri je med tvorbo prašnikov prišlo do izbrisa selekcijskega markerja. Takrat se je začela izražati rekombinaza Cre, ki je izbrisala lastno ekspresijsko kaseto in ekspresijsko kaseto za selekcijski marker, ki sta se nahajali med mestoma loxP. Po uspešni oprašitvi in tvorbi semen so dobili semena brez selekcijskega markerja, ki so jih označili kot “marker-free”.

Analiza transgenega riža

Pridobili so več linij kalusov, ki so bili odporni na higromicin, zato so opravili nadaljnjo analizo. Iz rastočih rastlin so izolirali DNA in z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) so preverili ali sta na DNA prisotna gena HPT in cre. Pri pozitivnih linijah so nato s PCR analizirali še prisotnost ostalih vnešenih genov. Geni za vse encime so bili uspešno vgrajeni v genom transgenega riža, zato so preverili še raven izražanja teh genov . Izolirali so RNA iz semen transgenega riža in z reverzno transkriptazo pripravili ustrezno cDNA. Vsi štirje geni, so se izražali, vendar je bila njihova raven izražanja različna, zato so rezultate normalizirali glede na ekspresijo gena osActin1.

HPLC-analiza vsebnosti astaksantina

Že sam fenotip trensgenih semen je kazal prisotnost astaksantina, saj so bila semena oranžnordeče barve, ki je značilna zanj. Dodatno so njegovo prisotnost potrdili tako, da so z metanolom pripravili ekstrakte transgenih semen in semen divjega tipa ter jih analizirali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. V transgenih semenih je bil astaksantin dominanten karotenoid, medtem ko v divjem tipu ni bil prisoten.

Uspešnost izbrisa selekcijskega markerja

S PCR so analizirali kasnejše generacije aSTARice in tako preverili ali je res prišlo do izbrisa selekcijskega markerja. V primeru uspešnega izbrisa so namreč dobili le eno liso ustrezne velikosti in tako so identificirali homozigotne linije brez selekcijskega markerja. Glede na prikazane rezultate je izbris selekcijskega markerja le redko uspel, saj so večinoma dobili dve lisi, ki kažeta na heterozigotni genotip. Večinoma je torej do izbrisa prišlo le na eni aleli, medtem ko je ena alela ohranila selekcijski marker.

Zaključek

Kitajska ekipa je uspešno pripravila transgeni riž, ki je v endospermu sintetiziral astaksantin in ga tam tudi shranjeval. Nadaljnje analize pa so pokazale tudi določene pomanjkljivosti, ki bi jih še lahko popravili. V kasnejših generacijah so zaznali zelo različne koncentracije astaksantina, saj je prišlo do velikih razlik v izražanju vnešenih genov. Predvsem se je precej znižala raven izražanja gena BHY, kar je koreliralo z znižanjem koncentracije sintetiziranega astaksantina. Poleg tega so pokazali, da je največja pozitivna korelacija med koncentracijo astaksantina in relativno ekspresijo prisotna ravno pri genu BHY, kar kaže, da gre za omejujočo stopnjo biosinteze. V primeru nadaljnjih raziskav bi morali izboljšati ekspresijo gena BHY in čim bolj standardizirati koncentracijo sintetiziranega astaksantina. Hkrati bi bilo dobro tudi izboljšati učinkovitost izbrisa selekcijskega markerja, saj prikazani rezultati kažejo, da so večinoma dobili heterozigotni genotip. Kljub določenim pomanjkljivostim je ekipa na tekmovanju zasedla skupno 3. mesto v kategoriji dodiplomskih študentov.

Viri

• Team:SCAU-China. http://2016.igem.org/Team:SCAU-China
• I. Higuera-Ciapara, L. Felix-Vanezuela, F. M. Goycoolea. Astaxanthin: a review of its chemistry and applications. Crit Rev Food Sci Nutr. 2006, 42(2), 185-196. http://dx.doi.org/10.1080/10408690590957188

Seminarji SB 2016/17