MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo

UVOD

Raziskovalna ekipa Univerze ShanghaiTech se s svojim projektom MagicBlock zavzema za prihodnost sintezne biologije, katero si predstavljajo kot skupek prispevkov s strani znanstvenikov iz različnih področij. Kljub temu pa delo z biokockami predstavlja velik izziv za ne-biologe, saj zahteva razumevanje kompleksnega molekularnega kloniranja in izobraženost o biološki varnosti. Pri svojem projektu se zavzemajo za to, da bi zgradili javno platformo za sintezno biologijo, ki bi bila dostopna širšemu krogu raziskovalcev. Svoj cilj so poskušali doseči s poenostavljenim konceptom »biokocke«, ki bi ga lažje predstavili javnosti. Namesto da bi uporabili genske kocke, so za »kocko« označili skupino funkcionalno opredeljenih bakterij. Zgradili so interaktivno platformo, ki združuje nadzor preko software-a s samodejnim sistemom za delo s tekočinami. S takšno platformo bi lahko večina ljudi, kar vključuje tudi osnovnošolce, preko interneta oblikovala svoje sintezno biološke poskuse, katere bi nato izvedel robot. Takšna platforma se imenuje MagicBlock in je sestavljena iz učinkovitega software vmesnika, bakterij ter robotov. Oblikovalci lahko uporabijo software-ski vmesnik za oblikovanje genskih vezij bioloških produktov. Številne biokocke (bakterije) so gojene v kulturi glede na genska vezja, ki so pridobljena iz strežnika (oblaka). Te bakterije so povezane z roboti, ki prenašajo tekočine s pomočjo supernatantnega prenašalca.

LUX-U PODOBEN QUORUM ZAZNAVNI SISTEM

Gram negativne bakterije med seboj komunicirajo preko Acil homoserin laktonov (AHL), katerih sinteza, preko družine AHL-sintetaz , poteka na relativno nizkem nivoju. Ko se bakterijska populacija poveča in sintetiziran AHL doseže kritično koncentracijo, se AHL veže in inducira dimerizacijo LuxR-podobnega prejemniškega proteina, ta pa nato proteinu omogoči vezavo na specifične promotorje za iniciacijo izražanja genov. Takšen način komunikacije med bakterijami je bil uporabljen za povezovanje MagicBlock biokock med seboj. Enostavne biokocke, ki imajo le eden Quorum zaznavni sistem so poimenovali »primarne biokocke«. Takšne enostavne kocke se večinoma uporabljajo kot vhodne in izhodne enote, odgovor na fizične ali kemične stimulante, pošiljalci vhodnih signalov do celotnega MagicBlock sistema ali pa proizvajajo visoke nivoje izhodnih reporterskih proteinov.Pojem »napredne biokocke« označuje biokocke, ki vsebujejo več kot eden Quorum zaznavni sistem. Uporaba več zaznavnih sistemov ni enostavna. Preučili so komunikacijo med AHL in njihovimi prejemniškimi proteini. Zaznavni sistem Pseudomonas aeruginosa in Rpa sistem Rhodopseudomonas palustris sta pokazala veliko ortogonalnost pri poskusih, zato sta bili ti bakteriji uporabljeni za konstrukcijo naprednih biokock.

AVTOMATIZIRANI PROCESI

Avtomatizirane naprave se pri projektu uporabljajo za prenos kulturnega supernatanta, prav tako pa povezujejo različne biokocke med seboj. Uporabniki bi lahko oblikovali genska vezja s pomočjo software-a z enostavnim uporabniškim vmesnikom, nato pa bi se njihov izdelek avtomatsko prevedel v strojno kodo, ki nadzira robote za prenos tekočin. Tako bi prenesli supernatant med bakterijskimi kulturami in povezali biokocke.

Hardware

Platforma je sestavljena iz vmesnika za strežnik (»oblak«), posebne cevi za bakterijsko kulturo in robota, ki prenaša tekočine. Po tem ko uporabnik izvede ukaz, genske vezi proizvedejo bioprodukt skozi strežnik, nato pa so bakterije, ki predstavljajo biokocke v genskem vezju, nacepljene v posebno cev. Cev lahko loči supernatant, ki vsebuje signalne molekule, od bakterijske celične mase. Supernatant se, s pomočjo robota, nato prenese v drugo izbrano cev in s tem poveže dve kocki v vezje. S pomočjo občutljivih genskih vezij je tako ustvarjen produkt, s tem, da oblikovalci izdelajo bioprodukt brez uporabe bioloških laboratorijev. Z ustreznim dizajnom bi lahko takšen prototip ustvarili v enem dnevu in z manj kot 180 dolarji, kar je cenovno zelo ugodno.

Magične biokocke (MagicBlock) predstavljajo bakterijske kulture z željeno zmožnostjo procesiranja informacij. Da bi bakterije povezali z jasnimi logičnimi pravili, morajo med seboj komunicirati v skladu z genskimi vezji. Z že prej omenjenim Quorum zaznavnim sistemom se morajo signalne kemikalije prenašati med bakterijami in s tem omogočiti nadaljnji prenos signala. Vseeno pa se je potrebno izogniti prenosu bakterijskih celic, da se minimizira mešanje različnih populacij bakterij. V ta namen so oblikovati posebno kulturno cev, s katero bi supernatant zlahka odsesali, celice pa bi ostale v originalnih ceveh. Zaradi cene in težav pri prizvodnji, se je ekipa ShanghaiTech-a odločila, da bo robota za prenos tekočin izdelala sama z rekonfiguracijo 3D tiskalnika skupaj z brizgalno črpalko. Vmesnik v tiskalniku omogoča avtomatski ali daljinski nadzor. Programirali so ploščad v 3D tiskalniku, da premika črpalko in s tem sesa ter prenaša tekočino iz posebne cevi.

Software

Software predstavlja ključno komponento, ki omogoča javni dostop do sintezne biologije brez izkušenj v laboratoriju. Nemogoče je, da bi veliko maso ljudi naučili konstruirati plazmide ali pa izvesti molekulsko kloniranje v biološkem laboratoriju, zato je ta software prilagojen tistim, ki imajo dobre ideje glede uporabe bioloških komponent in bi se radi izognili delu v laboratoriju. Poleg tega imajo ljudje, brez izkušenj v biologiji, dostop do oblikovanja svojih bioloških vezij. S pomočjo software-a lahko uporabniki zaključijo dejanska genska vezja le z izbiro in povezovanjem različnih standardnih delov. Pričakovano je, da bodo uporabniki z različnim znanstvenim ozadjem prispevali mnogo izjemnih dizajnov in s tem izkoristili potencial genskih vezij za reševanje praktičnih težav.

POSKUSI IN MODELIRANJE

V svojem modelu je ekipa poenostavila dejanski biološki proces v osnovni model, ki vključuje samo vhodno molekulo, promotor, transkripcijski gen, mRNA, ciljni protein in izhodno molekulo za dinamično perspektivo ter zmožnost odgovora. V razvojnem modelu so vzeli v obzir različne pogoje, ki vključujejo populacijsko rast, difuzijo signala in razpad signalnih molekul v celicah. Konstruirali so model za biokocke, ki bo uporabnika seznanil z uporabo sistema in vodil poskuse. Prav tako so prilagodili nove meritvene metode, ki merijo fluorescenco bakterij v realnem času in opravljajo nekatere osnovne raziskave o zaviranju rasti zaradi AHL. Cilj takšnega modela je pomoč pri razlagi opazovanih pojavov pri poskusih, prileganje parametrov za biokocke, meritev delovne učinkovitosti biokock in modeliranje bakterijske populacije znotraj MagicBlock-a.

S pomočjo izboljšanih modelov so uspeli odgovoriti na vprašanja o učinkovitosti biokock za vzdrževanje procesivnosti signala. Da bi določili učinkovitost signalne procesivnosti so naredili simulacijo AHL produkcije z eksperimentalnimi podatki in nato naredili predikcijo z ekspresijskim modelom. Model prav tako nudi predloge o času delovanja biokocke, preden so parametri določeni z eksperimenti.

Testi ortogonalne predikcije

Poleg podatkov iz literature so za oblikovanje modela uporabili molekularno prileganje za predikcijo afinitete Quorum zaznavne (QS) molekule homoserin lakton (HSL) do različnih QS prejemniških proteinov. Za konstrukcijo naprednih biokock v sistemu so uporabili Las sistem bakterije P. aeruginosa in RpaR sistem bakterije R. palustris, katera sta predvidoma relativno ortogonalna.

Prikaz komunikacije znotraj biokocke

Za prikaz komunikacije znotraj biokocke so najprej izmerili produkcijo AHL v generatorskih biokockah z metodama LC-MS (tekočinska kromatografija – masna spektrometrija) in fluorescenčno QS receptorsko razporeditvijo (receptor array). Obe metodi sta potrdili generacijo AHL-jev, kvantitativni rezultati pa kažejo na to, da je produkcija AHL-jev z MagicBlock-om zadostna za stimulacijo naslednje biokocke in za aktivacijo genske ekspresije.

Kinetični model MagicBlock

Po ekspresijskih poskusih je ekipa zbrala dovolj podatkov za opis kinetičnh značilnosti biokocke. Modelirali so odziv in regeneracijo AHL-jev in tipičnih intermediatnih biokock ter določili parametre za robotski prenos tekočin. S programom Matlab so pridobili krivuljo za protein, ki ga je sprožila vhodna signalna molekula.

ODZIV LJUDI

Z namenom, da bi svojo platformo vpeljali v praktično uporabo in dobili povratne informacije za nadaljnje izboljšave, je ekipa ShanghaiTech-a organizirala dve delavnici na katerih so predstavili osnovno idejo sintezne biologije in MagicBlock-a za oblikovanje lastnih bio-produktov. Prav tako so anketirali študente različnih smeri, ki so vključevale računalniško biologijo, sintezno biologijo in elektronsko inženirstvo. Mnenja anketirancev so prispevala ideje za nadaljnje izboljšanje hardware-a in software-a ter modeliranja. Zanimivo je, da so od ljudi dobili različne dizajne z elementi MagicBlocka, kot je alarm za vodno onesnaženje, sintetična glasba in bakterijska barvna paleta, katere so oblikovali ne-biologi. Takšni dizajni bi lahko služili kot navdih za nadaljnje raziskave s katerimi bi, s pomočjo MagicBlock-a, sintezno biologijo približali širši javnosti.

Povzeto po projektu iGEM ekipe Univerze ShanghaiTech