Main Page

Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9 1. UVOD Po ocenah svetovne zdravstvene organizacije se približno 75 % žensk tekom svojega življenja okuži s Candido albicans (C.albicans), ki velja za eno najpogostejših vulvovaginalnih okužb s kvasovkami. C.albicans je polimorfna kvasovka iz rodu kandida, ki je lahko del človeškega mikrobioma in pri ljudeh najpogosteje povzroča kandidozo. Zraste lahko v obliki kvasovke, prave hife ali psevdohife, pri čemer sta prvi dve obliki patogeni in povzročata okužbo. Okužbe so lahko sistemske in prizadenejo celo telo ali pa površinske in se pojavijo kot oralna ali vaginalna kandidoza. [1,2] Vulvovaginalna kandidoza (VVC), ki jo v 80 % jo povzroča C.albicans, velja za temeljni problem zdravja žensk po svetu. Še posebej so ji izpostavljene ženske z oslabljenim imunskim sistemom, imunosupresivnimi boleznimi in tiste, ki so že uporabljale antimikotike. Vsi ti dejavniki prispevajo k neuravnoteženemu razmerju mikroorganizmov v vaginalni flori in v tem primeru prekomerni rasti kvasovk. Akutne okužbe same po sebi niso nevarne, večje tveganje predstavlja razvoj kroničnih. Problem VVC je, da se ženske, ki sumijo na možnost okužbe, večinoma odločajo za samozdravljenje in nakup antimikotikov brez posveta z zdravnikom ali farmacevtom. Takšna nespecifična zdravljenja lahko privedejo do odpornosti mikrobov, nasploh pa antimikrobna rezistenca velja za globalen problem in se je v zadnjih letih drastično povečala. Tega problema se je lotila skupina mladih raziskovalcev tekmovanja iGEM 2018 UiOslo Norway, ki je razvila 'hiter detekcijski kit' Canditect za zaznavo okužbe s kvasovko C.albicans. Test temelji na uporabi sistema CRISPR/dCAS9 in naj bi omogočal hitro in zanesljivo zaznavo bolezni ter posledično učinkovito zdravljenje in bolj racionalno uporabo antimikotikov. [1] 2. PRISTOP – uporaba sistema CRISPR/dCas9 2.1. Opis sistema in sestava detekcijskega kita Canditect Pri razvoju testa Canditect je ekipa iGEM-a želela izkoristiti natančnost sistema CRISPR/dCas9 za detekcijo specifičnih DNA sekvenc v genomu kvasovke C.albicans. Spomnimo, da CRISPR/Cas9 sistem v osnovi deluje kot naravni obrambni sistem bakterij, najden pri bakteriji S.pyogenes. V tehnologiji DNA se je ta sistem razvil v eno najbolj učinkovitih in uporabnih metod za urejanje genoma. [3] Sistem CRISPR/dCAS9 se razlikuje od osnovnega sistema CRISPR/Cas9 predvsem v aktivnosti in vlogi nukleaze Cas9. CRISPR/dCas9 sistem je prilagojen za tehnologije CRISPRi (angl. CRISPR interference) in CRISPRa (angl. CRISPR activation). Ta sistema uporabljata encim dCas9 – deaktiviran Cas9 (angl. Cas9 endonuclease dead), ki ne more tvoriti DSB-jev (angl. double strand break) na dvoverižni DNA, vendar se je vseeno zmožen vezati na regijo genoma. To se pri teh sistemih kaže v RNA-usmerjeni represiji ali aktivaciji transkripcije. Sistem prav tako zahteva ustrezno vodilno RNA (sgRNA ali gRNA), ki se bo vezala na ustrezno mesto blizu promotorske regije in tja pripeljala encim dCas9. [4] Ekipa je test Canditect zasnovala tako, da je kot endonukleazni del sistema uporabila encim dCas9. Z induciranjem točkovnih mutacij na RuvC in HNH endonukleaznih domenah Cas9 so aktivnost encima inhibirali. Oblikovali so ustrezne gRNA za vezavo na tarčno mesto genoma kvasovke. V sistemu so uporabili tudi reporterski encim β-laktamazo. dCas9 so sestavili iz dveh delov, pri čemer so prvega fuzirali z N-končnim drugega pa s C-končnim delom encima β-laktamaze in tako ustvarili dvokomponentni sistem. Oba dela dCas9 se s pomočjo gRNA vežeta v neposredno bližino na tarčni DNA sekvenci kvasovke. Pri tem se oba dela β-laktamaze, ki sta vezana na dCas9 ponovno združita in postaneta encimsko aktivna. Ob dodatku substrata nitrocefina v reakcijsko mešanico le-tega cepi β-laktamaza in dobimo rdeče obarvan produkt, kar kaže na prisotnost DNA kvasovke. Za pridobitev proste DNA kvasovke so v detekcijskem kitu uporabili encim glukanazo, ki omogoči selektivno lizo celične stene kvasovk. [1] 2.2. Uporaba CANDITECT-a Ženski z domnevno okužbo s kvasovko C.albicans bi s sterilno vatirano palčko vzeli vaginalni bris in le-to vstavili v komplet za detekcijo okužbe Canditect. Ta bi z zgoraj opisanim detekcijskih kitom zaznal okužbo, saj bi glukanaza ob prisotnosti kvasovke s cepitvijo celične stene sprostila njeno DNA. Test bi s sistemom na osnovi CRISPR/dCas9 in reporterskega proteina β-laktamaze ter substata nitrocefalina zaznal prisotnost kvasovkine DNA z nastankom rdeče obarvanega produkta. Odčitavanje rezultata bi bilo možno s prostim očesom preko posebnega detekcijskega okna. [1] 3. NAČRTOVANJE in SINTEZA KOMPONENT SISTEMA 3.1. Kompleks dCas9-reporter Eden od ciljev skupine je bila uspešna fuzija endonukleaze dCas9 z N- ali C- koncem deljene β-laktamaze in nastanek funkcionalnega kompleksa dCas9-reporter. Pri njegovem oblikovanju so uporabili sekvenco dCas9 ekipe iGEM 2015 iz Pekinga in nanjo fuzirali en del deljene β-laktamaze (N- ali C- konec). Galarneat et al namreč v svojih raziskavah pokaže, da razdelitev β-laktamaze na dva fragmenta ne vpliva na njeno aktivnosti in encim postane biološko aktiven takoj, ko oba dela encima ponovno povežemo nazaj. Za fuzijo dCas9 z deljeno β-laktamazo so uporabili linker, sestavljen iz treh GGGGS ponovitev in oblikovali 4 različne kombinacije konstruktov (N- ali C- konec β-laktamaze in dCas9 pred ali za β-laktamazo). Zaradi velikosti in kompleksnosti konstuktov je bil problem v njihovi sintezi, zato so jih razdelili na dva posamezna dela in na ta način lažje izvedli samo sintezo. Konstrukte so pomnožili z uporabo metod kloniranja po Gibsonu v vektorju pSB1C3. Po sekvenciranju so DNA iz ustreznih kolonij vstavili v pBAD ekspresijski vektor, ki so ga transformirali v bakterijski sev BL21, namenjen za izražanje. Ustreznost izraženega proteinskega kompleksa so preverili z Western blotom. [1] 3.2. Vodilna RNA Eden pomembnejših delov projekta je bil odločitev, kateri del genoma kvasovke ciljati. Odločili so se za Hyphal wall protein 1 (HWP1), ki kvasovki omogoči, da gre v hife. Zanj so z analizami ugotovili, da je unikatna tarča za kvasovke. Sklenili so uporabiti 20 nukleotidov dolge gRNA, komplementarne sekvenci HWP1. Oblikovali so jih s pomočjo funkcije CRISPR v programski opremi, ki glede na tarčne DNA sekvence oblikuje najbolj efektivno gRNA. Naredili so štiri različne gRNA sekvence, ki so jih nato kombinirali v pare tako, da bi razdalja med njimi po vezavi na tarčno DNA znašala od 15 do 30 nukleotidov. Želeli so namreč najbolj optimalno ujemanje obeh delov encima in tako najboljšo možno obarvanost pri cepitvi substrata. [1] Za sintezo gRNA so uporabili gRNA generator, ki ga je razvila iGEM ekipa 2015 iz Pekinga. Generator deluje na principu sistema CRISPR/Cas9 II in vsebuje T7 promotor, gen lacZ, zapis za vodilno RNA brez tarčno-specifične sekvence ter T7 terminator. Tarčno-specifično sekvenco v generator vstavimo preko 2 restrikcijskih mest BsaI. [5] Za vstavitev tarčne DNA v generator so naredili ustrezne RNA oligonukleotide, ki so jih prilegali na tarčno DNA. Kompleks gRNA-oligo-DNA so s pomočjo kloniranja po metodi Golden gate vstavili v generator. Produkt kloniranja so transformirali v bakterije in jih dali na plošče s substratoma X-gal in IPTG za belo-modri test kot dokaz uspešnosti kloniranja. Ko so opazili modre kolonije, so preverili ustreznost DNA in izvedli reverzno transkripcijo vodilne RNA-oligo-DNA v gRNA z uporabo sinteznega kita in gRNA očistili. [1] 3.3. Litični encim glukanaza Celična stena kvasovk je sestavljena večinoma iz polisaharidov, predvsem mananskih sladkornih polimerov in β-glukanov, ki predstavljajo 47 – 60 % in so povezani z β-1,3 in β-1,6 glukozidnimi vezmi. [6] V namen selektivne lize celične stene so se odločili za uporabo encima β-1,3-glukanaze, ki jo proizvajajo nekatere bakterije. Odvzet vaginalni vzorec bo tako vseboval le prosto DNA kvasovke ne pa tudi DNA bakterij in človeških celic. Na ta način bi odpravili večino lažno pozitivih rezultatov. β-1,3-glukanazo so registrirali kot novo biokocko. Glukanazo so sintetizirali pri Twist Bioscience, njena sekvenca je bila kodon optimizirana za E.coli. Tudi tukaj so izvedli kloniranje po Gibsonu s pSB1C3 klonirnim vektorjem in nato z ekspresijskim vektorjem pBAD ter na koncu preverili ustreznost izraženega encima. [1] • Zadnji korak projekta je bil združiti vse elemente v funkcionalni kit. Idejo so vzeli od ostalih podobnih kitov in s 3D tiskalnikom ustvarili prototip testa Canditect. 4. REGISTRIRANI DELI Ekipa je v okviru svojega projekta registrirala novo biokocko endo-1,3-β-glukanazo, ki jo najdemo v sistemu biokock pod šifro BBa_K2711000. Sekvenco endo-1,3-beta-glukanaze so vzeli iz bakterije Cellulosimicrobium cellulans. Želeli so specifično lizo celic Candide albicans v vaginalnem vzorcu, ki prav tako vsebuje bakterije in tudi kožne celice. Z eksperimenti so pokazali, da je encim sposoben cepiti 1,3-β-glukanske vezi. Aktivnost endo-1,3-β-glukanaze je primerljiva z aktivnostjo 100-1000x raztopine komercialno dostopne zimolaze (2000 U/μl). V kombinaciji z mehansko silo in ustreznimi detergenti pričakujejo uspešno selektivno lizo celične stene. [1] 5. ZAKLJUČEK Ekipa UiOsloNorway je za Canditect, detekcijski sistem za prepoznavanje okužbe s kvasovko C.albicans, prejela nagrado za najboljši diagnostični projekt na tekmovanju iGEM 2018. Kot veliko prednost tega sistema so izpostavili njegovo fleksibilnost. S spreminjanjem vodilne RNA se lahko sistem prilagodi tako, da detektira praktično katerokoli DNA in to z veliko natančnostjo. To je velika prednost sistema, ki je zasnovan na osnovi CRISPR/Cas9, v primerjavi s sistemom TALEN-ov o uporabi katerega so prav tako razmišljali. Ob uspešnem delovanju sistema se lahko le-tega uporabi za postavitev diagnoz še za vrsto drugih bolezni in okužb. [1] 6. VIRI 1. iGEM UiOsloNorway 2018, Canditect: Fast detection of vulvovaginal Candida albicans infections using CRISPR/dCas9

http://2018.igem.org/Team:UiOslo_Norway/Experiments  [pridobljeno 4.12.2018]

2. Candida albicans https://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans [pridobljeno 4.12.2018] 3. Patrick D.Hsu, Eric S.Lander and FengZhang: Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014, 157, 1262-1278. 4. Antonia A. Domingue, Wendell A. Lim and Lei S. Qi: Beyond editing: repurposing CRISPR–Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2016, 17, 5-15. 5. sgRNA generator

http://parts.igem.org/Part:BBa_K1689000 [pridobljeno 5.12.2018]

6. Roman Kollar, Bruce B. Reinhold, Eva Petráková, Herman J. C. Yeh, Gilbert Ashwell, Jana Drgonová, Johan C. Kapteyn, Frans M. Klis and Enrico Cabib: Architecture of the yeast cell wall. JBC. 1997, 272, 17762-17775.