StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

StyGreen je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu S.cervisiae z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

UVOD

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena. Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

---

PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben Phe, ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali StyGreen-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

---

Kaj je dober vir celuloze ?

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan Recell®, ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

---

Razpad celuloze na glukozo

S. cerevisiae sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo β-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: endoglukanaza, celubiohidrolaza in β-glukozidaza. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

---

Pretvorba glukoze v StyGreen

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator fenilalanin amonum liaza 2. (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima dekarboksilaza ferulne kisline 1. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz A. Thaliana ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" />

---

Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba CRISPR-Cas9 v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

---

Kako poteka celotni proces ?

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je 
celulosom učinkovejši. 

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne 
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7)  in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med 
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat 
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja 
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij 
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem 
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

---

Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo RP-HPLC-DAD. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z 2% glukoze in 0,5 g / L fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl), 
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +), 
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-) 
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

---

ZAKLJUČEK

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje » Kako se znebiti plastike?« 

---

VIRI

<ref name="prvi" /> 1. [1]/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" />2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> [3.http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics] pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" />6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" />7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results pridobljeno dne 12.01.2019