SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike

My Clothes Plastic<ref>My clothes plastic. iGEM 2019 team Kyoto. https://2019.igem.org/Team:Kyoto.</ref> je projekt študentske ekipe Kyoto iz Japonske, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2019.

Avtorica povzetka: Vesna Podgrajšek

Problem mikroplastike

Človek v vsakdanjem življenju uporablja različne izdelke iz plastike. Težava, s katero se spopadamo je, da se plastika v naravnem okolju zelo počasi razgrajuje in se nenehno kopiči. Pri tem se zaradi abiotskih dejavnikov (UV-sevanje, temperatura) ustvarjajo delci plastike manjši od 5 mm, kar imenujemo mikroplastika<ref>A. K. Urbanek, W. Rymowicz, A. M. Mirończuk: Degradation of plastics and plastic-degrading bacteria in cold marine habitats. Appl. Microbiol Biotechnol. 2018, 102, 7669–7688.</ref>. Njena površina je zelo hidrofobna in gladka, zato se nevarne snovi, zlasti težke kovine ter tudi mikroorganizmi zlahka pritrdijo nanjo. Ko mikroplastiko pojedo morski organizmi, jim škodi in ogroža celoten ekosistem. Prav tako je tudi človeško telo izpostavljeno mikroplastiki, zlasti z zaužitjem hrane in vdihavanjem mikroplastike iz zraka. Ocenjuje se, da človek letno zaužije 39 000 do 52 000 delcev mikroplastike<ref>] J. C. Prata, J. P. da Costa, I. Lopes, A. C. Duarte, T. Rocha-Santos: Environmental exposure to microplastics: An overview on possible human health effects. Sci. Total Environ. 2020, 702, 1–31.</ref>. Mikroplastika nastane ne samo kot posledica razgradnje plastične embalaže in vrečk, ampak je tudi posledica pranja perila. V enem pranju perila nastane več kot 700 000 mikrovlaken in veliko tega ne zajamejo čistilne naprave ter se sprosti v okolje. Akumulacija mikroplastike je eden najresnejših okolijskih problemov. Ker še vedno ni učinkovitega načina za odstranjevanje mikroplastike iz okolja, so z uporabo sinteznobioloških orodij poizkusili odkriti način odstranjevanja mikrovlaken iz odpadne vode pranja in s tem preprečiti sproščanje v naravno okolje.

Projekt My clothes plastic

Ideja

Ideja ekipe Kyoto je bila razviti proteinski sistem SONOBE, ki bi spodbujal mikrovlakna, da se agregirajo in oborijo. V tem sistemu so proteini, ki vežejo plastiko (angl. plastic-binding protein, PBP), vezani na površino enkapsulinskega nanokompartmenta sestavljenega iz enkapsulinskih podenot. Vezava PBP je omogočena s sistemom SpyTag-SpyCatcher, ki spontano tvori močno izopeptidno vez, ki je ireverzibilna.

Proteinski sistem SONOBE se vnese v odpadno vodo s pomočjo naprave, ki so jo 3D natisnili in s katero opremimo pralni stroj. Naprava je zasnovana tako, da priskrbi proteinsko raztopino v odpadno vodo, samo ko pralni strop spusti odpadno vodo. Mikrovlakna se na poti do čistilne naprave agregirajo in usedejo, nato pa jih še odstranijo in sežgejo.

Priprava konstruktov

Enkapsulin SpyTmEnc (BBa_K3185000) so konstruirali tako, da prikaže protein SpyTag na površini enkapsulinskega nanokompartmenta - organelu podobna struktura. 60 enkapsulinskih podenot spontano tvori polimer v obliki sferične kletke premera 20 nm<ref> Y. Bae, G. J. Kim, H. Kim, S. G. Park, H. S. Jung, S. Kang: Engineering tunable dual functional protein cage nanoparticles using bacterial superglue. Biomacromolecules. 2018, 19, 2896–2904. </ref>. Za izhodišče so vzeli enkapsulin iz bakterije Thermotoga maritima (TmEnc). Peptid SpyTag je vstavljen po 138. aminokislini v TmEnc in je izpostavljen zunaj proteinske kletke kot zanka. Konstruirali so še dva TmEnc; TmEnc (BBa_K3185001) in sfGFP/TmEnc (BBa_K3185002), kateri ima na N-konec dodano še zaporedje sfGFP (angl. superfolder green fluorescent protein). Vsi trije konstrukti vsebujejo C-končno heksahistidinsko oznako (6xHis-tag), pred to oznako je hemaglutininska oznaka (HA-tag) in med 43. in 44. aminokislino vstavljeno še eno heksahistidinsko oznako (6xHis-tag).

Konstruirali so tudi sedem PBP, od katerih se vsak veže na različne tipe (polietilen tereftalat, PET; poliuretan, PU; polipropilen, PP) ter tudi oblike plastičnih materialov (mikrovlakna, folija, sintetično tkanino), kar omogoča fleksibilno uporabo sistema. Za izhodišče so vzeli PBP iz različnih organizmov (BaCBM2 iz bakterije Bacillus anthracis, CenA iz bakterije Cellulomonas fimi, izboljšana različica TA2 iz raka Tachypleus tridentatus, LCI KR-2 izboljšana različica LCI iz bakterije Bacillus subtilis, hidrofobin iz bakterije Bacillus subtilis, PETaza in izboljšana PETaza iz bakterije Ideonella sakaiensis). Vsak PBP je bil s fuzijo povezan s proteinom SpyCatcher (SpyC->BaCMB2: BBa_K3185004, SpyC->CenA: BBa_K3185005, SpyC->PETaza: BBa_K3185009, SpyC->ePETaza: BBa_K3185010). Dvema PBP (SpyC->sfGFP->LCI KR-2: BBa_K3185006, SpyC->sfGFP->TA2: BBa_K3185007) so na N-konec dodali še zaporedje sfGFP. Enemu PBP pa so dodali GST zaporedje (GST->SpyC->hidrofobin: BBa_K3185008). S tem pristopom lahko enkapsulinski nanokompartment veže do 60 s SpyCatcher povezanih PBP. Vsi proteini vsebujejo heksahistridinsko oznako (6xHis-tag) za čiščenje, oznako MYC (MYC-tag) za detekcijo s protitelesi ter prepoznavno mesto za proteazo TEV.

Eksperimentalni del in rezultati

Izražanja in čiščenje rekombinantnih proteinov

Najprej so klonirali deset genov oz. konstruktov za proteinski sistem SONOBE v plazmidih pET-11a. Konstrukte so vstavili med restrikcijski mesti za BamHI in NdeI. Ekspresijske plazmide so vnesli v celice BL21(DE3) in gene izrazili s T7 promotor/RNA polimeraznim sistemom. Vsak rekombinantni protein nosi polihistidinsko oznako (6xHis-Tag), zato so za čiščenje uporabili Ni-afinitetno kromatografijo. Čistost eluatov so potrdili s NaDS PAGE. Tri PBP (SpyC->PETaza, SpyC->ePETaza in SpyC->hidrofobin) od desetih se niso uspešno očistili.

Zaključek

Cilj projekta My clothes plastic je bil rešiti težavo sproščanja mikroplastike v odpadno vodo pri pranju perila in preprečiti sproščanje v naravno okolje. Ta sistem je enkapsulinski nanokompartment, na katerega se vežejo PBP preko sistema SpyTag-SpyCatcher. Proteinski sistem SONOBE se vnese v odpadno vodo in spodbuja mikrovlakna, da se agregirajo in oborijo. Poleg tega so izračunali optimalno količino proteinskega sistema, ki ga je potrebno dati v odpadno vodo za pranje perila, izdelali pa so tudi strojno opremo za uvedbo proteinskega sistema v odpadno vodo. Projekt so uspešno speljali do konca ter predstavili tudi možnosti za izboljšavo sistema.

Viri

<references/>