Prenos informacije med bakterijami v sesalskem črevesju z uporabo sistema zaznavanja gostote populacije.

Sesalski mikrobiom

Sestava mikrobioma črevesja ima pomembno vlogo pri vzpostavljanju in ohranjanju imunskega sistema gostitelja, prehranjenosti črevesnih celic, proizvodnji metabolitov in zaščiti pred patogeni. Njeno sestavo pa lahko spreminjamo s spremembo prehranskih navad, uživanjem antibiotikov in s fekalno transplantacijo. Te spremembe pa so po navadi celostne in nepredvidljive, kar za kontrolirano preiskavo takšnih sistemov ni ravno optimalno [1].

Sistem zaznavanja gostote bakterij

O komunikaciji med bakterijami mikrobiote je znanega zelo malo. Sistema zaznavanja gostote bakterij preko analogov acil-homoserin laktona, ki je sicer prisoten pri po Gramu negativnih bakterijah, kot je Vibrio fischeri, v črevesju kljub visoki gostoti in raznovrstnosti celic mikroflore še niso zaznali. Takšni sistemi so sicer splošno uporabljeni za uvedbo medcelične komunikacije, zato so ga v tej raziskavi uporabili za vzpostavitev umetnega prenosa informacije med Escherichio coli in oslabljeno Salmonello enterico typhimurium, ki sta obe lahko prisotni v mišjem črevesju. Osnovni sistem sestoji iz oddajnika, ki izloča inducibilni signal, in sprejemnika, ki zaznava in interpretira sprejeti signal [2, 3, 4].

Cilj takšnih študij je z uporabo robustnih sintezno-bioloških pristopov v načrtovanih bakterijah mikrobiote vzpostaviti kompleksne celične vzorce in interakcije s črevesnimi celicami, ki bi posredno preko pretoka informacij z AHL izvajali kompleksna opravila, kot je denimo vpliv na zdravje posameznika [4].

Zasnova genetskih elementov v E. coli

Tipično zaznavanje gostote temelji na signaliziranju in zaznavanju majhnih organskih molekul, ki lahko prosto difundirajo v sosednjo celico. Tam te molekule povzročijo izražanje genov iz operona lux V. fischeri. LuxI je sintaza signalnih molekul acil-HSL, medtem ko je LuxR transkripcijski faktor, ta potem aktivira tarčne gene le, ko je nanj vezana tudi primerna verzija acil-HSL. V naravi se takšni sistemi koristijo za specifično zaznavanje gostote populacije ter na ta način nadzorujejo delovanje skupnosti kot celote (tvorba biofilma, proizvodnja virulenčnih faktorjev) [3, 4].

Zasnova oddajnika

Oddajnik je bil načrtovan tako, da so v genom vstavili smerni signalni element. Ta efektivno proizvaja verzijo AHL, natančneje N-(3oksoheksanoil)-L-HSL (3OC6HSL), ki ga lahko celica proizvede zgolj kot odgovor na oralno zaužit analog tetraciklina - anhidrotetraciklin (ATC). Če ATC v celici ni prisotnega, smerni signalni element konstitutivno proizvaja represor TetR, ki blokira promotor PtetA, zaradi česar tudi ne pride do proizvodnje homologa proteina LuxI, ki zapisuje sintazo za 3OC6HSL. Ob prisotnosti že zelo nizke koncentracije ATC je vezava represorja TetR onemogočena, kar omogoči izražanje proteina LuxI, s čimer tudi pride do sinteze 3OC6HSL. 3OC6HSL potem kot signal prosto difundira v sosednje sprejemniške celice [3, 4, 5].

Zasnova sprejemnika

Sprejemnik je bil zasnovan na takšen način, da evidentira in se odzove na signalne molekule 3OC6HSL. Pri tem pa so uporabili dva kompleksnejša genetska elementa, ki pa ne vplivata na rast ali fitnes posameznih celic [4, 5].

Lux-sprožilni element

Lux-sprožilni element so v genom integrirali mesto-specifično med dva divergentna promotorja za araC in araB. Ta element zapisuje optimiziran zapis gena luxR, ki je pod nadzorom konstitutivnega promotorja PlacIQ. Promotor PlacIQ je sicer mutirana optimizirana verzija promotorja gena lacI. Konstitutivno izražen protein LuxR se, ko je nanj vezan 3OC6HSL, veže na Lux-škatlo znotraj promotorja PluxI, ki so ga vzeli iz V. fischeri, ter tako aktivira transkripcijo gena za protein Cro. Promotorja PluxI in PlacIQ sta bila med seboj ločena s približno 80 vmesnimi bp, za vsakim pa se je nahajal tudi optimizirani sintetični RBS, ki so ga vzeli iz biokock (BBa_B0029). Na tem elementu se za potrebe selekcije nahaja tudi konstitutivno izražen gen za odpornost na kloramfenikol [4, 5, 6].

Spominski element

Nastali protein Cro nadalje vpliva na spominski element. Ta element deluje kot standardno cI/Cro genetsko stikalo bakteriofaga λ iz E. coli, ki so ga integrirali v genom. To stikalo je optimalno, saj ima represor cI že po naravi zelo močno in stabilno vezavo na DNA in lahko izpade zgolj ob ustrezni mutaciji. Profag lambda tudi ni energetsko preveč obremenilen za celico, saj je protein cI prisoten zgolj v nekaj sto monomerih na celico [5].

Sistem stikala Cro/cI pri bakteriofagu regulira preklop iz lizogenega v litično stanje. V lizogeni fazi mora biti večina genov blokiranih, kar počne represor cI preko blokade litičnega promotorja pR. Hkrati pa cI aktivira tudi lastno transkripcijo preko avtoreguliranega promotorja pRM. Ob indukciji litične faze, ko sta v nizkih koncentracijah prisotna tako Cro kot tudi cI, pride do s Cro posredovane inaktivacije cI, kar sprosti litični promotor pR, tako da se začne prepisovati protein Cro. Cro tako efektivno pripelje do povišanja lastne transkripcije (avtoaktivacija). Cro možnosti avtoaktivacije nima, če hkrati v nizki koncentraciji ni prisotnega tudi nekaj cI. Sintetizirani Cro se nato direktno veže na pRM in tako preprečuje transkripcijo cI, kar je ključno, saj le močno znižana količina cI omogoči stabilen prehod v litično fazo ter preprečuje ponovni nastanek lizogenega stanja [5, 7, 8, 9].

Pri zasnovi tega elementa so za tridelnim levim operatorjem vključili gene rexAB, cI, cro in lacZ. Pred OL se nahaja zgolj konstitutivno izražen gen za rezistenco na kanamicin. Spominski element pred vklopom izraža represor cI, ki preko oligomerizacijske tvorbe zanke povezuje operatorski regiji OL2-OL1 z OR1-OR2, kjer se tudi nahaja pR, s čimer je onemogočeno izražanje dveh zaporedno vezanih nižje ležečih genov; lacZ, ki omogoča izvedbo belo-modrega testa za prepoznavanje celic z vključenim stikalom, ter dodatne kopije gena cro [4, 5, 10].

Do začetka vklopa stikala pride, ko je v sprejemniku prisotnih okoli 100 molekul proteina Cro, ki se sintetizirajo iz aktiviranega sprožilnega elementa. Cro se namreč veže na pRM znotraj OR3 ter s tem onemogoči prehod RNA polimeraze, torej izražanja proteina cI. Po štirih delitvah celic se količina represorja cI v celici zadosti razredči (pade pod 10 odstotkov osnovnega stanja), da pride do inicijacije litične faze (prehod iz stanja cI v stanje Cro). Zaradi pogoja štirih celičnih delitev morajo biti sprejemniki v prisotnosti 3OC6HL vsaj nekaj ur, da dejansko pride do preklopa stanj. V stanju Cro je potem zaustavljena represija litičnega promotorja pR. Promotor pR sedaj povzroči izražanje β-galaktozidaze za izvedbo belo-modrega testa ter druge kopije gena cro, kar omogoči stabilno tvorbo pozitivne povratne zanke, ki zagotavlja, da ostane pRM blokiran ter stikalo vključeno, tudi po 150 delitvah od odmika signala 3OC6HSL, ko Cro iz sprožilca ne nastaja več. Delovanje takšnega stikala je tako dovolj robustno, da se ohrani tudi po prečenju črevesja, zaradi česar lahko vklop stikala zaznamo iz izločkov [4, 5, 10, 11].

Zasnova genetskih elementov v S. typhimurium

Tukaj so morali sprva ustvariti oslabljeni sev, ki na miš nima negativnih učinkov. Temu sevu so odstranili patogena segmenta znotraj proteinov SPI-1 in SPI-2, ki sodelujeta pri vstopu v gostiteljsko celico. Princip, ki je bil uporabljen pri E. coli, so uporabili tudi pri zasnovi oddajnikov in sprejemnikov pri S. typhimurium, le da so zapisom optimizirali kodon [4].

Eksperimentalne ugotovitve

Delovanje sistema in vitro

Delovanje sprejemnikov

Preizkus ustvarjenega sintezno-biološkega sistema so najprej opravili tako, da so in vitro preverili, če oddajnik dejansko proizvede 3OC6HSL ter če se sprejemnik nanj vidno odzove. Odziv sprejemnikov E. coli na 3OC6HSL so kvantificirali z deležem modrih kolonij z vklopljenim stikalom. Sprejemniki E. coli so se izkazali kot dobri biosenzorji, saj so se odzvali hitro po izpostavitvi signalu in z visoko občutljivostjo (nM koncentracije 3OC6HSL), hkrati pa je bilo vklopljeno stikalo tudi zadosti dolgoživo, da so ga ustrezno zaznali. Sprejemniki S. typhimurium imajo slabšo občutljivost in zakasnjen odziv ob stimulaciji s 3OC6HSL, kar naj bila sicer posledica tekmovanja z manj učinkovitim homologom proteina LuxR, proteinom SdiA, ali pa posledica slabše kompatibilnosti in učinkovitosti genetskih elementov, ki temeljijo na osnovi bakteriofaga lambda, ki naravno napada zgolj E. coli [3, 4].

Delovanje oddajnikov

Količino proizvedenega 3OC6HSL v oddajniških celicah so preverili po indukciji z ATC, tako da so na gojiščih z razmazi supernatantov gojili sprejemnike ter odziv podobno kot prej identificirali z belo-modrim testom ter primerjali rezultate s standardom iz prve meritve. Oddajniki obeh vrst so ob indukciji z ATC vselej proizvajali 3OC6HSL z visoko mero učinkovitosti, kljub uporabi zgolj ene integrirane kopije gena homologa luxI. Proizvodnja 3OC6HSL pri S. typhimurium je bila slabša kot pri E. coli (šestkrat slabša pri normaliziranih pogojih), a vseeno zadostna za okolje s tako veliko številsko gostoto celic [4].

Delovanje sistema in vivo

Pri testih in vivo v črevesju miši so oba zasnovana seva oralno vnesli v miške. Po dveh dneh pa so testnim osebkom oralno v vodi dodali še ATC. Analiza je potem potekala na osnovi mišjih izločkov na selektivnih ploščah, kjer so določali delež sprejemnikov z vklopljenim stikalom. Po dnevu dodajanja ATC je do dolgotrajnega vklopa signala prišlo pri večini mišk, kasneje pa več ne. Prenos informacij v črevesju je kompleksen, kar se tudi odrazi v variaciji stopnje odziva med mišmi. V splošnem je bil delež vklopa višji pri bakterijskih sistemih iz ene same vrste kot pa v medvrstnih sistemih oddajnikov in sprejemnikov. Delež vklopljenih stikal pri posamezni miši naj bi bil povezan tudi s stopnjo kolonizacije, razlikah v preostali črevesni mikrobioti, metabolizmu, količini ATC, ki je dejansko prišel do črevesja, ter variaciji razdalj med kolonijami v črevesju, ne pa kot posledica slabega delovanja stikala [4].

Model vklopa sprejemnikov

Ustvarili so tudi model, s katerim so želeli napovedati delež celic z vključenim stikalom znotraj ko-kultur sprejemnikov in oddajnikov v odvisnosti od števila oddajnikov. Model kaže kako oddajnik povzroča dinamične spremembe v koncentraciji 3OC6HSL v bližnjem okolju. Model temelji na treh predpostavkah (stalno mešanje, zanemarljiva razgradnja in izguba 3OC6HSL) in ima napovedno moč le v sistemih in vitro, kjer lahko koncentracijo signalnih molekul 3OC6HSL izračunamo ob kateremkoli času iz hitrosti proizvodnje 3OC6HSL, gostote celic v mediju ter časa izpostavljenosti [4].

Viri

[1] Rinninella, E., Raoul, P., Cintoni, M., Franceschi, F., Miggiano, G., Gasbarrini, A. in Mele, M. C. (2019). What is the Healthy Gut Microbiota Composition? A Changing Ecosystem across Age, Environment, Diet, and Diseases. Microorganisms, 7(1) ,14.

[2] Swearingen, M.C., Sabag-Daigle, A. in Ahmer, B.M.M. (2013) Are there acylhomoserine lactones within mammalian intestine? J. Bacteriol. 195, 173-179.

[3] Ng, W. L. in Bassler, B. L. (2009). Bacterial quorum-sensing network architectures. Ann. rev. genetics, 43, 197–222.

[4] Kim, S., Kerns, S.J., Ziesack, M., Bry, L, Gerber, G.K., Way J.C. in Silver P.A. (2018). Quorum Sensing Can Be Repurposed To Promote Information Transfer between Bacteria in the Mammalian Gut, CS Synth. Biol. 7, 9, 2270-2281.

[5] Kotula, J.W., Kerns, S.J., Shaket, L.A., Siraj, L., Collins, J.J., Way, J.C., and Silver, P.A. (2014). Programmable bacteria detect and record an environmental signal in the mammalian gut, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111, 4838-4843.

[6] Calos, M. P. (1978). DNA Sequence for a Low-Level Promoter of the Lac Repressor Gene and 1013 an “Up” Promoter Mutation. Nature, 274 (5673), 762–765.

[7] Lee, S., Lewis, D.E.A. in Adhya, S. (2018). The Developmental Switch in Bacteriophage λ: A Critical Role of the Cro Protein. J Mol Biol, 430, 58-68.

[8] Johnson, A.D., Poteete, A.R., Lauer, G., Sauer, R.T., Ackers, G.K. in Ptashne, M. (1981). Lambda Repressor and cro--components of an efficient molecular switch. Nature. 294(5838), 217-223.

[9] Schubert, R.A., Dodd, I.B., Egan, J.B. in Shearwin, K.E. (2007). Cro's role in the CI Cro bistable switch is critical for {lambda}'s transition from lysogeny to lytic development. Genes Dev. 21(19), 2461-2472.

[10] Teif, V.B. (2007). General transfer matrix formalism to calculate DNA-protein-drug binding in gene regulation: application to OR operator of phage lambda. Nucleic Acids Res. 35(11), e80.

[11] Yartseva, A., Klaudel, H., Devillers, R. in Képès F. (2007). Incremental and unifying modelling formalism for biological interaction networks. BMC Bioinfo. 8(1):433.