PHEAST - P. pastoris za odstranjevanje metana

Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je s projektom PHEAST sodelovala na tekmovanju iGEM leta 2021 in se uvrstila med deset najboljših ekip.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:DTU-Denmark

Avtorica povzetka: Ana Potočnik

Problem

Metan (CH4) je toplogredni plin, katerega masni delež v ozračju je 0,0001 %. Industrija in kmetijstvo vsako leto v ozračje izpustita 570 milijonov ton metana. Njegov toplogredni učinek je tridesetkrat večji kot toplogredni učinek ogljikovega dioksida, zato je eden izmed ciljev trajnostnega razvoja tudi zmanjšanje izpustov metana oziroma razvoj metod, ki bi omogočale omilitev negativnih posledic izpustov. Trenutno je največji poudarek na zmanjšanju izpustov metana s spreminjanjem hrane živine, prav tako pa so tudi že aktualne strategije, ki temeljijo na odstranjevanju že izpuščenega metana. Mednje spadajo recikliranje in kompostiranje odpadkov, zajemanje metana ter sežiganje. Glavna vrednost metana je vir energije, ampak je zajemanje in sežiganje metana dražje v primerjavi z drugimi viri energije. Poleg tega se pri sežiganju sprošča ogljikov dioksid, ki je prav tako toplogredni plin. Jasno je, da doslej uporabljane metode bistveno ne zmanjšajo ravni izpustov metana, zato je potreba po učinkovitih strategijah za odstranjevanje metana iz atmosfere velika. Kot odgovor na okoljski stres so se že razvili organizmi, ki lahko preživijo v okoljih, bogatih z metanom. Najpogosteje jih najdemo na riževih poljih, v blatu, prsti ali na odlagališčih smeti. Največji pomen za spopadanje z okoljsko krizo imajo metanotrofne (metanofilne) bakterije. Ena izmed njih je gramnegativna bakterija Methylococcus capsulatus, ki metan uporablja kot vir ogljika in ga pretvarja v metanol. Doslej niso našli višjih organizmov, ki bi lahko presnavljali metan, so pa odkrili seve kvasovk, ki so razvile učinkovite mehanizme za prevzem in pretvorbo metanola v biomaso in energijo na podlagi metabolnih poti, podobnih M. capsulatus [1, 2].

Cilj

Skupina podiplomskih študentov DTU Denmark je v prej opisanem problemu videla možnost za razvoj seva kvasovk, ki bi metan lahko prevzemal iz okolja, ga presnavljal in s tem uporabljal kok vir ogljika. Za to nalogo so si izbrali kvasovko Komagataella phaffii (Pichia pastoris). K. phaffii je metilotrof, ki kot vir ogljika in energije uporablja metanol, prav tako pa je eden izmed organizmov, ki ga uporabljamo za industrijsko proizvodnjo proteinov. Njihova ideja je bila vključiti kompleks pMMO (angl. particular methane monooxygeanse) iz M. capsulatus, ki pretvarja metan v metanol, ki ga K. phaffii lahko s pomočjo nativnih metabolnih poti uporabi kot vir ogljika in energije. Glavni cilj v okviru te ideje pa je bil razvoj javno dostopnih orodij za urejanje genoma K. phaffii za namen odstranjevanja metana. Doslej ta orodja v registru iGEM niso bila dostopna in kljub veliki razširjenosti K. phaffii v industriji je bil delež biokock v registru za K. phaffii (in P. pastoris) manj kot 1 %.

Načrt in izvedba

Za delecijo in integracijo genov v genom K. phaffii je skupina razvila sisteme CRISPR/Cas9 z uporabo orodij molekulskega kloniranja, tehnologije DNA in sintezne biologije.

Izbira šasije

Izbrali so sev K. phaffii GS115 Δku70, ki nima gena ku70, zaradi česar v celici ne more prihajati do spajanja nehomolognih koncev (NHEJ). Zaradi tega je celica za popravljanje dvoverižnih prelomov na DNA prisiljena uporabiti popravljanje s homologno rekombinacijo (HDR). To omogoči lažjo integracijo genov v genom K. phaffii [3]. Orodje za delecijo in kromosomsko integracijo Za delecijo in integracijo so razvili sisteme CRISPR/Cas9. Glavni razlog za uporabo CRISPR/Cas9 sistemov je ta, da je tarčenje DNA z RNA bolj tehnično enostavno in časovno izvedljivo kot tarčenje DNA s proteinom. Najprej so na genomu v nekodirajočih regijah poiskali nevtralna integracijska mesta, dolga 500 – 2000 bp, ki so bila dovolj dostopna endonukleazi Cas9 (niso na telomerah). Na vsakem izmed štirih kromosomov so izbrali eno integracijsko mesto. Nato so po strogih kriterijih načrtovali 4 sgRNA, vsako za eno integracijsko mesto. Zapise za izbrane sgRNA in Cas9 so nato vnesli v vektorje. Vektorji so vsebovali še mesto ori, zapis za rezistenco proti ampicilinu, marker za kvasovke in GAP1. Za pripravo vektorjev so uporabili kloniranje in fuzijo USER (angl. Uracil-Specific Excision Reagent), ki omogoča direktno vstavljanje vključkov v kompatibilne vektorje USER s pomočjo zarezovalnega encima. Vektorje so nato klonirali v kompetentnih celicah E. coli DH5α. Učinkovitost tarčenja z različnimi sgRNA so testirali z metodo TAPE, kjer so pričakovali, da ima sev GS115 Δku70 nižjo viabilnost kot sev GS115 [4]. Ko so izbrali najbolj primerne sgRNA, so s pomočjo sistemov CRISPR/Cas9 lahko izbili določene gene, celice pa so kotransformirali z matrico, ki vsebuje dve 45 bp dolgi homologni zaporedji, ki se nahajata navzgor in navzdol od izbitega gena, in sodeluje pri popravljanju s homologno rekombinacijo. Gene so lahko tudi vstavili, če so celice kotransformirali z drugo matrico, ki prav tako vsebuje dve homologni zaporedji in med njima še zapis za promotor, želeni gen in terminator, kar omogoča vstavljanje gena na mesto, kjer je bil uveden dvoverižni prelom DNA s Cas9 [5].

Razvoj metanotrofnih kvasovk

Geni, ki so jih vnesli v sev K. phaffii GS115, zapisujejo za kompleks pMMO, ki ga sestavljajo tri podenote PmoA, PmoB in PmoC. To so prokariontski geni, ki izhajajo iz metanotrofne gramnegativne bakterije M. capsulatus. Za optimalno izražanje genov v K. phaffii so izvedli optimizacijo kodona. Za delovanje kompleksa pMMO se morajo vse tri podenote transportirati do membrane in tam pravilno povezati v nonamer (3α3β3γ). Kompleks se nahaja v celični membrani in omogoča najprej oksidacijo metana do metanola in nato še prenos metanola v celico [6]. Želeli so, da se podenote pMMO izražajo konstitutivno, da bi se metan lahko ob prisotnosti v mediju takoj pretvarjal. Načrtovali so matrice za popravljanje dvoverižnih prelomov, ki so vsebovale zapise za podenote pMMO in močne konstitutivne promotorje GAP1 in TEF1. V zapis so vključili tudi signalni peptid, ki je izhajal iz glikoziltransferaze K. phaffii, ki je membranski protein. Lokalizacijo kompleksa so preverili z metodo DeepLoc. Za vnos genov so uporabili prej opisan sistem CRISPR/Cas9. Za preverjanje uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice so v genomu K. phaffii izbili neesencialne gene, ki so bili vključeni v nativnem metabolizmu metanola [7].

Rezultati

V okviru projekta PHEAST so uspešno pripravili več različnih plazmidov CRISPR/Cas9 za usmerjeno urejanje genoma K. phaffii na različnih kromosomih. S temi plazmidi je omogočena delecija genov brez »brazgotin« ali stabilna integracija genov. Vrednotenje dela so razdelili na tri dele, in sicer najprej zasnovo sistemov CRISPR/Cas9, nato uporabo sistemov CRISPR/Cas9 za delecijo genov in nazadnje še integracijo genov v K. phaffii GS115. Uspešno so zasnovali sgRNA, ki ciljajo intergenske regije na štirih kromosomih, kar bi lahko v prihodnosti uporabili za urejanje genoma K. phaffii. Z delecijo neesencialnih genov, vključenih v metabolizem metanola do formaldehida, so želeli pokazati, da ti geni rast le upočasnijo in ne povsem ustavijo. Prav tako jim je delecija teh genov služila pri preverjanju uspešnosti odstranjevanja metana iz okolice. Pokazali so tudi, da je integracija v genom K. phaffii možna, čeprav jim ni uspelo vstaviti točno želene popravljalne matrice.

Uvedba v industriji

K. phaffii je že industrijsko uveljavljen organizem za proizvodnjo rekombinantnih proteinov. Z uvedbo genov za kompleks pMMO bi K. phaffii postala metanotrofna in bi zato lahko predstavljala potencialen način odstranjevanja metana iz okolja. Metanotrofen sev K. phaffii bi gojili v fermentorju, do kamor bi transportirali metan. Razlog za to je evropska regulativa o GSO, ki narekuje, naj delo z GSO poteka v kontroliranem in zaprtem okolju. Zato se velik delež dela v prihodnosti usmerja v to, kako razviti učinkovito odstranjevanje metana, ki ne potrebuje GSO, da se bo to lahko izvajalo direktno na želenem mestu. Do takrat pa je najprej potreben zajem metana, po katerem bi se ta transportiral do fermentorja. Svojim strankam bi skupina ponudila tudi proizvajanje želenega proteina, ki bi ga K. phaffii proizvajala. Dodatno oviro predstavlja tudi slaba topnost metana v vodi, ampak naj bi element trajnostnega razvoja odtehtal slabši izkoristek. Skupina s svojim projektom cilja predvsem na kmetijstvo, saj bi stranke v sproščenem metanu lahko našle vrednost s pomočjo te proizvodne platforme, ki bi omogočala odstranjevanje metana in proizvodnjo proteinov kot hranil za živino. Projekt pa bi bil lahko pomemben tudi za oljno in premogovno industrijo, kjer je metan eden glavnih stranskih produktov.

Viri

[1] S. Guerrero-Cruz, A. Vaksmaa, M. A. Horn, H. Niemann, M. Pijuan, A. Ho: Methanotrophs: Discoveries, Environmental Relevance, and a Perspective on Current and Future Applications. Front. Microbiol. 2021, 12. [2] H. J. Kim, J. Huh, Y. W. Kwon, D. Park, Y. Yu, Y. E. Jang, B. R. Lee, E. Jo, E. J. Lee, Y. Heo, et al.: Biological Conversion of Methane to Methanol through Genetic Reassembly of Native Catalytic Domains. Nat. Catal. 2019, 2, 342–353. [3] L. Bernauer, A. Radkohl, L. G. K. Lehmayer, A. Emmerstorfer-Augustin: Komagataella Phaffii as Emerging Model Organism in Fundamental Research. Front. Microbiol. 2021, 11. [4] L. Näätsaari, B. Mistlberger, C. Ruth, T. Hajek, F. S. Hartner, A. Glieder: Deletion of the Pichia Pastoris KU70 Homologue Facilitates Platform Strain Generation for Gene Expression and Synthetic Biology. PLoS One 2012, 7. [5] Q. Liu, X. Shi, L. Song, H. Liu, X. Zhou, Q. Wang, Y. Zhang, M. Cai: CRISPR-Cas9-Mediated Genomic Multiloci Integration in Pichia Pastoris. Microb. Cell Fact. 2019, 18. [6] M. Karbalaei, S. A. Rezaee, H. Farsiani: Pichia Pastoris: A Highly Successful Expression System for Optimal Synthesis of Heterologous Proteins. J. Cell. Physiol. 2020, 235, 5867–5881. [7] F. W. Krainer, C. Dietzsch, T. Hajek, C. Herwig, O. Spadiut, A. Glieder: Recombinant Protein Expression in Pichia Pastoris Strains with an Engineered Methanol Utilization Pathway. Microb. Cell Fact. 2012, 11.