Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz Rhodosporidium toruloides

Povzeto po članku: X. Guo, Z. Bai, Y. Zhang, H. Zhao, S. Shi: Mining and application of constitutive promoters from Rhodosporidium toruloides. AMB Express 2023, 13, 1–12.

Uvod

Rhodosporidium toruloides je kvasovka rdeče barve, ki sodi med oljnate mikroorganizme. Za njih je značilno, da lipidi predstavljajo vsaj 20% njihove suhe mase. R. toruloides lahko v večjih količinah sintetizira lipide, maščobne alkohole, metile in etilne estre maščobnih kislin in karotenoidov.

Zaradi zmožnosti biosinteze raznovrstnih produktov, visoke odpornosti na stres in rasti v različnih gojiščih je perspektiven kandidat za uporabo v industriji. Za industrijsko aplikacijo je potrebna optimizacija metabolne poti, za kar je nujno predhodno poznavanje večjega nabora različno močnih konstitutivnih promotorjev. Za nemodelni organizem je bilo do sedaj odkritih 31 promotorjev, ki so v večini povezani s hišnimi geni ali geni, ki regulirajo akumulacijo lipidov. Eden izmed prvih karakteriziranih močnih konstitutivnih promotorjev je bil PGPD1, ki je promotor gena za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo. Moči ostalih do sedaj znanih promotorjev so bile določene relativno na moč PGPD1 in se gibljejo 0,2-11,0-kratno močjo PGPD1.

S pomočjo poznavanja večjega števila promotorjev in njihovih značilnosti je optimizacija biosinteznih poti maščobnih kislin lažja. V rastlinah poteka pretvorba stearinske kisline (nasičene maščobne kisline z 18 C atomi) v linolno kislino v dveh korakih z uvedbo dveh dvojnih vezi. Prvi encim je Δ9 desaturaza, ki med 9. in 10. C atom v stearinski kislini uvede dvojno vez, pri čemer nastane oleinska kislina. Drugi encim Δ12 desaturaza pa uvede dvojno vez med 12. in 13. C atom, da nastane linolna kislina. Za optimizacijo poti linolne kisline je torej potrebno optimizirati izražanje genov FAD9 in FAD12 za desaturazi.

Iskanje in karakterizacija promotorjev

Gojenje kvasovk in analiza transkriptoma

R. toruloides so gojili v različnih gojiščih za gojenje kvasovk kot so YPD (yeast peptone dextrose), YPX (yeast peptone xylose), popolno gojišče in minimalno gojišče. Naredili so analizo transkriptoma z določanjem nukleotidnega zaporedja RNA kvasovk, ki so rasle v različnih medijih, in na podlagi najpogosteje izraženih genov določili potencialne kandidate za močne konstitutivne promotorje.

Priprava plazmidov za karakterizacijo promotorjev

Za analizo moči promotorjev so pripravili plazmide pKOCAR2 s kaseto reporterskega gena EGFP, ki je vsebovala zapise za različne promotorje, EGFP in terminator 35S. Kvasovke so transformirali z metodo z Agrobacterium tumefaciens posedovanje transformacije (ATMT), pri kateri je prišlo do vstavitve kasete v CAR2 gen preko homolognih regij. Pri vstavljanju kasete v CAR2 je prišlo do delecije gena za karoten ciklazo, zaradi česar so bile kolonije bele barve. Transformiranih celicam so izmerili fluorescenco v eksponentni in stacionarni fazi rasti in jo normalizirali na število celic.