NETLANTIS

Skupina iz Kopenhagna je leta 2022 na tekmovanju iGEM s projektom NETLANTIS zasedla prvo mesto v skupini podiplomskih študentov. V okviru projekta so želeli razviti biorazgradljivo ribiško mrežo. Predstavitev projekta je dostopna na povezavi: https://2022.igem.wiki/ucopenhagen/

Problem

Vsako leto se v oceanih izgubi ogromno ribiških mrež, ki povzročijo več sto tisoč smrti morskih živali vsako leto – med drugim tudi zaščitenih vrst, kot so delfini, kiti in želve. Ribiške mreže iz najlonskih vlaken potrebujejo od 600 do 800 let, da se razgradijo. Med razgradnjo pride do fragmentacije mrež v oceanih in sprostitve mikroplastike, kar pripomore k njenemu kopičenju v prehrambeni verigi, ki vpliva tudi na nas. Skupina iz Kopenhagna je želela razviti biorazgradljivo alternativo ribiškim mrežam, ki bi bila sestavljena iz vlaken, ki temeljijo na proteinih [1].

Načrt projekta

Biorazgradljiva mreža bi temeljila na močnih vlaknih, ki jih najdemo v okolju. Ta vlakna so še dodatno optimizirali, da bi jih prilagodili na ostre pogoje v morskem okolju. Izhajali so iz proteinov pajkove svile ter vlaknastega proteina aneroina, ki ga najdemo v morski vetrnici. Ti proteini dajejo mreži elastičnost ter visoko natezno trdnost, vendar pa niso vodoodporni. Da bi še izboljšali moč vlakna ter ga naredili vodoodpornega, bi ga obdali z zaščitnim slojem proteina Mfp (angl. mussel foot protein). Gre za zaščitni protein, ki ga najdemo v zunanjem sloju bisusnih niti klapavice, ki omogočajo školjkam pritrjanje na podlago. Proteine jedra vlakna ter zaščitne proteine bi med seboj povezali preko SnoopTag-SnoopCatcher sistema. Tako bi pripravili močna, vendar biorazgradljiva vlakna, ki ne povzročajo mikroplastičnega onesnaževanje in bi jih lahko uporabili kot trajnostni material za proizvodnjo ribiških mrež [1].

Proteini pajkove svile

Proteine pajkove svile bi uporabili v jedru vlakna, saj so elastični in imajo visoko natezno trdnost. Svilena vlakna so sestavljena iz proteinov z N in C-končno domeno ter centralno regijo, ki vsebuje visoko ponovljive motive. Izmenjujeta se regiji bogati z alaninom in glicinom, ki tvorita alfa vijačnico. Ko pride do preje svilenih vlaken se ti proteini skoncentrirajo in regije se preuredijo v beta plošče. Nastane močno omrežje vodikovih vezi, ki so odgovorne za moč vlaken. N in C-končna domena pa omogočata proteinske interakcije preko disulfidnih vezi ter solnih mostičkov [1].

Minispidroin

Minispidroin je rekombinanten protein pajkove svile, sestavljen iz N-konca proteina MaSp1 (angl. major ampullate spidroin 1) in ponavljajočega dela Euprosthenops australis ter C-konca proteina MiSp (angl. minor ampullate spidroin) Araneus ventricosus. Gre za dobro topne regije, ki so občutljive na spremembe v pH. Visoka topnost je pomembna, saj omogoča, da dosežemo visoke koncentracije proteina, občutljivost na pH pa olajša konformacijske spremembe – formacijo omrežja beta ploskev [1].

MAKI - morski minispidroin

Iz fragmentov različnih proteinov pajkove svile so naredili tudi MAKI – morski minispidroin. Gre za popolnoma nov, hibridni protein. Izhajali so iz pajkove svile morskega pajka Desis marina. Želeli so narediti protein, ki bi zdržal v ostrem morskem okolju. Ko je svila izpostavljena vlagi namreč pride do pojava superkontrakcije, kjer voda prodre v vlakno in zmoti omrežje vodikovih vezi, vlakno tako nabrekne ter se skrči. Nekatere vrste pajkov, kot je tudi Desis marina, pa so sposobne tudi pod vodo presti mrežo [1].

Aneroin

Izrazili so tudi aneroin – svili podoben protein iz morske vetrnice Nematostella vectensis. Funkcija tega proteina ni znana, vendar pa vsebuje ponavljajoče se motive, bogate z glicinom in prolinom. Glede na to so sklepali, da bi bil protein lahko vključen v lovljenje plena ter potencialno tvorjenje vlaken [1].

Mfp151

Proteini pajkove svile so fleksibilni, lahki ter vsestransko uporabni, vendar pa je ocean zelo ostro okolje, polno bakterij, proteaz in soli, zato tam svilena mreža ne bi dolgo zdržala. Da bi rešili to težavo, so se ponovno obrnili na naravo. Mfp151 je hibridni protein sestavljen iz Mfp5 in Mfp1, ki je bil v preteklosti že izražen in opisan [1, 2].

Proteine Mfp klapavice izločajo iz noge in jim dajejo zmožnost, da se pripnejo na mnoge površine. Bogati so s tirozinskimi aminokislinskimi ostanki, ki jih hidroksilira encim tirozinaza in tako nastanejo lepljive DOPA skupine. Ugotovili so, da Mfp151 lahko postane lepljiv protein ter se veže na svileno vlakno, vendar pa se sčasoma oksidira ter tako izgubi večino lepljivosti in ne deluje več kot učinkovita zaščitna plast svilenega vlakna. Zato so dizajnirali nov Mfp151, kot fuzijo s SnoopCatcher proteinom, ki se ireverzibilno in spontano kovalentno veže na SnoopTag, ki je lahko fuziran npr. z minispidroinom [1].

Konstrukcija vektorjev in rezultati

Ker so delali s proteini, ki vsebujejo veliko ponavljajočih regij sta kloniranje ter PCR predstavljala oviri. Uporabili so metodi Golden Gate in USER (angl. uracil-specific excision reagent) kloniranja. Vse načrtovane proteine so izrazili v sevu BL21(DE3) E. coli [1].

Za pripravo rekombinantnega proteina pajkove svile minispidroina so uporabili Golden Gate kloniranje. Zaporedje so razdelili na dva dela ter vsakega vstavili v svoj vektor. N in C-konec proteina so vstavili v ekspresijski vektor pET24(+) s T7 promotorjem ter His-tagom na C-koncu proteina, vmesno, ponavljajočo se regijo pa v klonirni vektor pChlor Twist. Z vključitvijo BsaI restrikcijskih mest jim je uspelo umestiti ponavljajoči se del med konca v ekspresijskem vektorju. Protein so izrazili ter ga očistili s pomočjo nikljeve afinitetne kromatografije. Zaradi slabega izkoristka izolacije proteina so His-tag iz C-konca proteina prestavili na N-konec. To so dosegli s PCR z uporabo začetnih oligonukleotidov, ki vključujejo uracil. Sledilo je USER kloniranje, kjer USER encim cepi specifično načrtovane konce pri uracilu in tako nastanejo kompatibilni lepljivi konci. Prednost te metode je, da ni potrebna uporaba ligaze in da na tak način lahko povežemo več fragmentov v specifičen produkt s samo eno reakcijo. Na tak način jim je uspelo izolirati skoraj osemkrat več produkta. Proizvodnjo proteina so uspeli izvesti tudi na večji skali, v bioreaktorju. Protein so nato skoncentrirali ter iz njega spredli svilena vlakna [1, 3].

Uspelo jim je tudi izraziti in izolirati Mfp151. Protein so razdelili na dva dela, N-končno regijo so vstavili v ekspresijski vektor pET24(+), C-končno regijo pa v klonirni vektor pChlor Twist. Z uporabo BsaI restrikcijskih mest so C-končno regijo vstavili v ekspresijski vektor za N-končno regijo ter tako dobili celoten zapis za Mfp151 v ekspresijskem vektorju pET24(+). Protein so uspešno izrazili ter očistili. Da so lahko potekle posttranslacijske modifikacije tirozinskih aminokislinskih ostankov v DOPA skupine, so v istih celicah izvedli še koekspresijo prSET A vektorja z vstavljenim zapisom za tirozinazo in njen kofaktor orf438 [1].

Na minispidroin so želeli kovalentno povezati Mfp151, zato so na C-konec minispidroina dodali še zapis za SnoopTag ter na C-konec Mfp151 zapis za SnoopCatcher. Oba fuzijska proteina so uspešno izrazili v bakterijah in ju izolirali. Nato pa so proteina zmešali, pustili reakcijo teči 40 minut ter proteine analizirali z NaDS PAGE. Tako so potrdili, da se proteina med seboj povežeta [1].

Poleg tega jim je uspelo izraziti in izolirati še dva proteina. Prvi je MAKI – morski minispidroin. Protein je kombinacija med MaSp iz morskega pajka D. marina ter ponavljajočo se regijo minispidroina (MaSp iz E. australis). Ko so načrtali zaporedje, so ga vstavili v ekspresijski vektor pET24(+). Tudi v primeru tega proteina, so His-tag prestavili iz C-konca na N-konec, kot pri minispidroinu [1].

Zadnji protein je aneroin, ki je bil popolnoma nov za iGEM. Celotni protein so razdelili na tri dele: N-konec, osrednji del ter C-konec. N-končni del so vstavili v ekspresijski vektor pET24(+), ostala dva dela pa v klonirna vektorja pTwist Chlor. Vse tri dele so združili z uporabo BsaI restrikcijskih mest in tako uspeli izolirati in očistiti tudi aneroin [1].

Prihodnost in izboljšave

S SnoopTag-SnoopCatcher sistemom bi lahko na svileno vlakno pripeli še druge proteine in tako ribiškim mrežam dali dodatne lastnosti in funkcije. Lahko bi šlo za vključitev pigmenta, ki odbija rake ali pa morda bioluminiscence, saj je bilo pokazano, da svetloba lahko odganja želve ter morske sesalce stran od ribiških mrež. Na tak način bi se lahko izognili velikemu problemu nenamernega ulova [1].

Viri

[1] NETLANTIS https://2022.igem.wiki/ucopenhagen/

[2] Fichman G. et al. Antibacterial Gel Coatings Inspired by the Cryptic Function of a Mussel Byssal Peptide. Adv Mater. 2021. doi: 10.1002/adma.202103677.

[3] Hussam H. Nour-Eldin et al. Advancing uracil-excision based cloning towards an ideal technique for cloning PCR fragments. Nucleic Acids Res. 2006. doi: 10.1093/nar/gkl635.