Nekodirajoča regulatorna RNA pri arhejah

Uvod

Ne kodirajoča regulatorna RNA(ncRNA) ali tudi poimenovana majhna RNA(sRNA) je prisotna v vseh domenah življenja. V bakterijah in evkariontih je že dobro raziskana in opravlja naloge transkripcijske regulacije, replikacije kromosomov, procesiranja RNA in njene modifikacije, mRNA stabilnosti in translacije in tudi degradacije in translokacije protinov.

V evkariontih je bilo najdeno več različnih vrst sRNA. Med njimi najbolj raziskana je mikroRNA(miRNA), ki regulira ekspresijo proteinov v ključnih celičnih procesih. Te so dolge 20–30 nt in tvorijo komplekse z argonavtskimi proteini, katerih homologe najdemo tudi v arhejah, a imajo drugačno funkcijo in ni dokazov za podobno interakcijo z sRNA.

V bakterijah so sRNA ponavadi dolge od 50 do 300 nt in delujejo na mRNA translacijo in stabilnost ali se vežejo na proteine. Poznamo dva tipa glede na način vezave baz na tarčne mRNA: Cis-kodirano protismerno RNA(asRNA) in Trans-kodirano protismerno RNA ali tudi intergenska sRNA(itsRNA). asRNA so kodirane na DNA nasprotni svojem tarčnem genu. Njihova funkcija je represija transpozonov in sinteze strupenih proteinov ter modulirajo ekspresijo transkripcijskih regulatorjev. itsRNA pa so kodirane na lokacijah stran od gena svoje tarčne mRNA, kot so intergenske regije. itsRNA se vežejo le z delno komplementarnostjo na 5′ ali 3′ konec mRNA in blokirajo vezavo ribosomov ali sprožijo degradacijo mRNA. Preko vezave na več tarčnih genov in ključnih transkripcijskih faktorjev ter regulatorjev lahko itsRNA modulira ekspresijo velikih regij DNA.

V arhejah pa so funkcije in mehanizmi sRNA še slabše razumljene. Velikost arhejske sRNA je od 50 do 500 nt. Več vrst sRNA so našli tudi v arhejah, med njimi tudi asRNA in itsRNA, podobne tiskim ki jih najdemo v bakterijah. V tem povzetku se bomo fokusirali na te dve vrsti sRNA. Najprej bomo pogledali, kakšne metode se uporabljajo za detekcijo arhejskih sRNA in katere smo našli v arhejah do zdaj. Potem bomo razložili mehanizme delovanja nekaterih raziskanih arhejskih sRNA in pogledali s katerimi molekulami sRNA interagira. Na koncu bomo pogledali še prihodnost arhejskih sRNA raziskav.

Metode odkrivanja sRNA

Na začetku so se za identifikacijo sRNA zanašali na bioinformacijske analize celotnega genomska zaporedja arhej.

Danes se uporabljajo metode sekvenciranja RNA(RNA-seq), ki omogočajo merjenje genske ekspresije, anotacijo mej transkripcije in operonov, poleg tega pa identifikacijo sRNA in protismernih RNA. Tako lahko karakteriziramo celoten set transkriptov v celici in njihovo količino v določenem razvojnem nivoju ali fiziološkem stanju. Temu rečemo tudi transkriptom. V ospredju so vse metode, ki izkoriščajo visoko globino sekvenciranja in visoke zmogljivosti Illumina tehnologij. Globina sekvenciranja opiše celotno številom branj pridobljeno od visoko zmogljivega sekvenciranja, te številke so v milijonih. Glavni metodi sta diferencialno RNA sekvenciranje(dRNA-seq) in velikostno-določeno, verigo-specifično sRNA sekvenciranje(sRNA-seq).

dRNA-seq omogoča identifikacijo globalnih začetnih transkripcijskih mest na resoluciji nukleotida, s selektivno obogatitvijo primarnih transkriptov, a ta metoda ne pove nič o dolžini sRNA.

Posebej modificirana metoda sRNA-seq protokola je bila uporabljena za verigo-specifično globoko sekvenciranje na tisoče sRNA v H. volcanii. S to metode lahko zaznamo celotno dolžino sRNA, prepoznamo če so asRNA ali itsRNA in potencialne tarče teh sRNA.

Glede bioinformacijskih analiz pa še ni bila narejena nobena specifična metoda za identifikacijo podatkov sRNA-seq v arhejah.

Identifikacija arhejske sRNA

Naše znanje o sRNA v arhejah je omejeno le na nekaj raziskav hipertermofilov, metanogenov in haloarheona Haloferax volcanii.

Haloarheoni so halofilna haloarheja, ki jih najdemo v raztopinah z visoko koncentracijo soli. Najbolj presenetljivi raziskavi sta bili narejeni na H. volcanii. Te mikroorganizmi so izjemno odporni na visoke nivoje oksidativne stresa, ki jih povzročajo zunanji pogoji. S škodo povzročeno zaradi oksidativnega stresa se spopadajo z različnimi mehanizmi, a bistveno za robustnost teh procesov je najverjetneje genska regulacija preko transkripcijskih faktorjev in sRNA. Konstrukcije genskih mutantov z izbrisanimi geni za znana sRNA zaporedja je pokazala pomembnost le teh za veliko bioloških funkcij.

Z sRNA-seq so našli več kot 2900 sRNA v tej arheji, katere genom kodira le 4000 proteinov. Iz teh dveh raziskav je jasno, da je velik delež RNA pravzaprav nekodirajoče. Bilo je identificiranih 1500 asRNA in 400 itsRNA, torej jih je večina protismernih. Kar 30 % sRNA je vsebovala bazalne transkripcijske promotorje, kot je škatla TATA in so kazali podobne ekspresijkse nivoje tem od mRNA, kar kaže njihovo pomembnost pri globalni regulaciji genskih omrežij. V arhejah kot v bakterijah so števila itsRNA v merilu stotih in je potrebno več dela za validacijo in karakterizacijo njihovih vlog.

V manjših številkah so bile sRNA najdene tudi v drugih vrstah arhej. V Sulfolobus solfataricus so našli 185 asRNA in 125 itsRNA, kar predstavlja 6.1% njenega genoma.

Viri

1. Gelsinger, Diego Rivera, and Jocelyne DiRuggiero. “The Non-Coding Regulatory RNA Revolution in Archaea.” Genes 9, no. 3 (March 2018): 141. https://doi.org/10.3390/genes9030141.

2. Gelsinger, Diego Rivera, and Jocelyne DiRuggiero. “Transcriptional Landscape and Regulatory Roles of Small Noncoding RNAs in the Oxidative Stress Response of the Haloarchaeon Haloferax Volcanii.” Journal of Bacteriology 200, no. 9 (April 9, 2018): e00779-17. https://doi.org/10.1128/JB.00779-17.