PhaseOut

Towards Sustainable Agriculture: PHAse Out Microplastics from Our Food Chain, ali 'Na poti do trajnostnega kmetijstva'

Prisotnost mikroplastike v naravi prinaša vedno več vprašanj in skrbi glede vpliva, ki ga lahko ima na človeško zdravje. Nekatere raziskave pravijo, da ljudje pojemo do 5 gramov mikroplastike na teden in da velik delež te mikroplastike prihaja iz naslova kmetijstva. Mikroplastika je definirana kot majen plastični delec, ki nastane z mehansko razgradnjo plastik, ki niso biorazgradljive. Težava zaužitja ni le plastika sama, ampak tudi vse snovi, ki se na to plastiko adsorbirajo in se akumulirajo v rastlinah in v živalih. Takšne snovi so lahko toksične težke kovine ali pa različne kemikalije, ki se uporabljajo v kmetijstvu. Vir te mikroplastike so velikokrat plastične zastirke za zatiranje pleveli in ogrevanje zemlje in gnojila s kontroliranim sproščanjem. Čeprav njihova uporaba pomeni sproščanje mikroplastike, je njihova uporaba nepogrešljiva za produktivnost kmetijskega sektorja, zato so inovativna nadomestila takšnih tehnik kmetovanja zelo pomembne teme raziskovanja.

Skupina projekta PHAse Out leidenske univerze se je tega problema lotila s ciljem, da plastike iz fosilnih virov zamenja za polihidroalkanoate (PHA), ki so trajnostni in cenovno ugodni za uporabnike, prav tako pa so kompatibilni s proizvodnimi procesi za plastike iz fosilnih virov. Težava proizvodnje takšne bioplastike je, da tradicionalen vir ogljika – sladkor, ni trajnosten vir in je hkrati del človeške prehrane, posledično pa je ekonomsko manj stabilna. Projekt PHAse Out zato za vir ogljika uporablja t.i. zeleni metanol, ki je pridelan iz obnovljivih virov, kot je CO2 ali rastlinska biomasa.

Kaj je zeleni metanol?

Zeleni metanol je kemijsko enak navadnemu metanolu. Od njega se razlikuje v načinu pridobivanja. Medtem ko metanol, ki ga srečujemo npr. v laboratoriju nastane s procesiranjem zemeljskega plina, nastane zeleni metanol iz obnovljivih virov in procesov. Pri njegovem procesiranju se uporablja le elektrika iz obnovljivih virov energije. Poznamo dve vrsti zelenega metanola - eden je biometanol, ki nastane s procesiranjem rastlinske in živalske biomase, drugi pa e-metanol, ki za vir vodika uporablja zeleni vodik in ujet ogljikov dioksid. Pri obeh procesih se za okolje škodljivi plini reciklirajo.

Za organizem, s katerim bi producirali PHA, so v projektu izbrali Metilobacterium extorquens, ki metanol uporablja kot edini vir ogljika. S sinteznobiološkimi tehnikami so poskušali izboljšati učinkovitost proizvodnje PHA skozi izboljšanje biosinteze in ekstrakcije. Uporabili so štiri različne pristope. Prvi je bil optimizacija promotorja, drugi prekomerno izražanje genov v sintezni poti PHA, tretji izbitje poti biosinteze karotenoidov, četrti pa izbira sistema inducirane avtolize iz bakteriofagnega sistema. Analogno so raziskavo razdelili na cikle A, B, C in D.

Cikel A – izbira promotorja

V ciklu A so testirali učinkovitost različnih konstitutivnih in inducibilnih promoterjev tako, da so konstruirali plazmide na osnovi vektorja pTE100, v katerih promoterjem sledi mesto RBS in reporterski protein mCherry, katerega fluorescenco so merili.

V prvem delu so testirali delovanje konstitutivnih promotorjev za prekomerno izražanje phaC in groES/EL. Iz literature so izvedeli, da je promotor, ki povzroča najbolj intenzivno izražanje proteinov v M. Extorquens, promotor PmxaF, ki nadzira izražanje gena, ki zapisuje za veliko podenoto metanol dehidrogenaze. Ta promotor je aktiven pri visoki koncentraciji metanola v mediju, zato je v tem eksperimentu konstitutivno aktiven. Poleg PmxaF so testirali še promotorje, ki inducirajo nižje izražanje od njega – preizkusili so PfumC, ki ima 5-15% promotorsko moč, relativno na PmxaF; PcoxB, s 40-50% moči relativno na PmxaF in Ptuf, ki ima 70-100% moč glede na promotor PmxaF.

Za namene induciranja avtolize so testirali različne inducibilne promotorje. PA1/O4/O3 in PL/O4/A1, ki ju inducira IPTG; PQ5 and PQ2148, ki ju inducira kumat; PV106, ki ga inducira vanilat in pCinR, ki ga inducira OHC14. Ti promotorji imajo podobne strukture in v okolju brez indukcijskih molekul, se izražajo represorski geni, katerih produkti se vežejo na operatorsko regijo. V prisotnosti molekul, ki njihovo delovanje inducirajo, se represor inaktivira in omogoča izražanje reporterskega proteina mCherry. Želeli so identificirati promotor, ki čim manj pušča, da bi lahko nadziral izražanje avtolizne regije, ki bi povzročila lizo bakterij v prisotnosti induktorja.

Po izdelavni konstruktov so testirali njihovo produktivnost z merjenjem fluorescence, ki jo povzroča reporterski protein mCherry. Najintenzivnejša fluorescenca je bila izmerjena pri vzorcu s promotorjem PmxaF. Vsi rezultati so prikazani na sliki xxx.

Rezultati za inducibilne promotorje so precej slabi, ker so pri eksperimentu naredili napako – pri pCinR so za indukcijo uporabili IPTG namesto OHC14. Najintenzivnejšo fluorescenco so pri induktivnih promotorjih izmerili pri PL/O4/A1,ki so ga uporabili tudi kasneje, v ciklu D.

Cikel B – povečanje produkcije PHA s prekomernim izražanjem genov

V ciklu B so se osredotočili na optimizacijo prekomernega izražanja genov phaC, groEL in groES. PhaC zapisuje za sintazo PHA, groEL in groES pa za kompleks groEL/ES, ki je šaperon in sodeluje pri zvijanju PhaC. Pripravili so konstrukt vseh promotorjev z phaC, groES/EL in z obema, kot je predstavljeno na spodnji shemi. Na koncu zapisov za proteine so dodali zapis za HIS-tag za ekstrakcijo. Ugotovili so, da je za vsak genski konstrukt, ki ga bakterije producirajo in prepisujejo, optimalen drugačen promotor. Prav tako so ugotovili, da je prekomerno izražanje bolj učinkovito, če je na konstruktu zapis za phaC in groEL/ES hkrati. Za kvantitativno primerjavo ekspresije so tekoče kulture pobarvali z barvilom Nile-red, ki obarva PHA. Kvalitativno so obarvanje opazovali tudi s fluorescenčnim mikroskopom. Fotografije so predstavljene na spodnji sliki.

Cikel C – izbitje genov za biosintezo karotenoidov

V ciklu C so želeli zmanjšati metabolni napor, ki ga prinašajo metabolne poti, ki bakteriji v industrijskem okolju ne koristijo. Izbrali so biosintezno pot za karotenoide. Karotenoidi celicam v naravi dajejo zaščito pred UV-sevanjem, kar pa v kontekstu biološke proizvodnje ni relevantna težava, ker kulture v bioreaktorjih niso izpostavljene UV-sevanju. Poskusili so izbiti tri različne gene – dxr, ispA in crtI. To so storili s postopkom dvojne rekombinacije s plazmidom, ki je vseboval gen za odpornost na kanamicin, ki je na začetku in na koncu imel 750bp dolg zapis za 3' in 5' konca gena, ki so ga izbijali. Navzgor od zapisa za odpornost in končne regije so vstavili tudi zapis za mCherry. Potek dvojne rekombinacije so zagotvaljali z gojenjem na gojišču z antibiotikom in hkrati z merjenjem fluorescence. Bakterije, ki so zrasle na gojišču s kanamicinom in hkrati niso fluorescirale, so zanesljivo imele izbit tarčni gen.

Uspelo jim je le izbitje gena crtI, niso pa izvedli kvantifikacije produkcije PHA po izbitju tega gena. S kvantifikacijo bi lahko bolje opisali posledico izbijanja sistema biosinteze karotenoidov na količino proizvedenega PHA.

Cikel D - izbira optimalnega sistema inducibilne avtolize

Za ta namen so poskusili v bakterijah izraziti bakteriofagni sistem lize, ki bi povzročil lizo bakterij. Bakteriofagi, ki bi specifično okužili M. extorquens še niso bili identificirani, zato so uporabili 5 različnih genskih konstruktov iz fagov, ki okužijo bakterije, ki so filogenetsko blizu M. extorquens. Konstrukti so prikazani na spodnji shemi.

Največjo smrtnost – torej zmanjšanje števila CFU v primerjavi z negativno kontrolo – so opazili pri sistemih Gp110 iz salmonele in EJ1 iz pnevmokokov. So pa pri vseh opazili tudi, da ni pomembne razlike v vzorcih z ali brez induktorja, kar pomeni, da inducibilni promotorji ne delujejo oz. zelo močno puščajo. Zaradi neuspelega poskusa niso mogli kvantificirati vpliva avtoliznega sistema na učinkovitost ekstrakcije PHA.

Zaključki

PHAse Out je imel za glavni cilj ustvariti cenovno ugodno in trajnostno rešitev za biološko proizvodnjo PHA v organizmu M. extorquens z uporabo zelenega metanola kot glavnega vira ogljika. Uspešno so izmerili učinkovitost konstitutivnih in inducibilnih promotorjev v takšnem sistemu. Uspešno so določili tudi kako prekomerno izražanje genov za sintazo PHA in šaperonskih proteinov vpliva na produkcijo PHA. Delno so tudi kvantificirali delovanje fagnih sistemov za namene avtolize, vendar jim ni uspelo ustvariti inducibilnega konstrukta z zanemarljivim puščanjem promotorja.

Viri

1 Green methanol: the fuel that can accelerate the energy transition in shipping (https://www.iberdrola.com/about-us/what-we-do/green-hydrogen/green-methanol) 2 PHAse out (https://2023.igem.wiki/leiden/)