OASYS

Uvod

OASYS je projekt študentske Indijske skupine IISER-TMV, ki je sodelovala leta 2023 na tekmovanju projektov iGem. OASYS je zasnovan kot diagnostični pripomoček za klinično depresijo, njegove aplikacije pa segajo v prognozo, sledenje antidepresivom, klinična preskušanja zdravil in napredne znanstvene raziskave. Sestavljen je iz mikrofluidne naprave z dvema različnima sistemoma kvantifikacije na osnovi fluorescence za merjenje ravni petih krvnih biomarkerjev, povezanih z veliko depresivno motnjo (MDD). Zasnovali so tudi sistem strojne opreme, ki lahko zazna fluorescentne odčitke in jih poveže z ravnmi biomarkerjev v krvi. [1]

Klinična depresija

Klinična depresija ali velika depresivna motnja (MDD) je kompleksen in heterogen klinični sindrom, za katerega je značilno vztrajno depresivno razpoloženje, izguba zanimanja za dnevne aktivnosti in fizični simptomi, kot so spremembe apetita, spremembe vzorca spanja in utrujenost. Trenutno naj bi bilo v svetu kar 280 milijonov ljudi z to boleznijo in po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) naj bi do leta 2030 postala ena najpogostejših bolezni.

Največji problem pri duševnem zdravju in psihološki oskrbi trenutno predstavlja pomanjkanje virov in neustrezne informaciji. Milijoni ljudi z depresijo nimajo dostopa do strokovne pomoči in velika večina je diagnosticirana kasneje kot bi želeli zaradi napačno razumljenih simptomov.

Metode diagnosticiranja MDD so v večini sestavljene iz vprašalnikov za samoprijavo in kliničnih razgovorov, na katerih pacienti velikokrat ne odgovarjajo resnično ravno zaradi strahu pred diagnozo z depresijo, saj še vedno velja velika stigma okoli duševnih bolezni, predvsem v bolj nerazvitih državah kot je Indija. OASYS tako nudi objektivno pomoč pri diagnozi MDD. [1]

OASYS

OASYS je mikrofluidna naprava na osnovi FRET (fluorescenčno resonančnega prenosa energije), ki lahko kvantificira in analizira biomarkerje, kot so nevrotransmiterji, mikroRNA, hormoni in beljakovine v serumu človeške periferne krvi. Krvni biomarkerji, ki so povezani z MDD ter so jih izbrali s pomočjo Bayesove analize, so nevrotransmiter serotonin, hormon kortizol, nov protein - Gsα in dve mikroRNA - 124 in 132.

Ravni serotonina (5-hidroksitriptamin) v krvi se pri bolnikih z depresijo zmanjšajo, medtem ko ravni kortizola povečajo. Kortizol je splošno znan kot stresni hormom. Proteini G, znani tudi kot proteini, ki vežejo gvaninske nukleotide, so proteini, ki služijo kot molekularno stikalo v celicah in prenašajo signale zunanjih dražljajev v notranjost celice. Vpleteni so tako v nastanek depresivnih stanj kot tudi v delovanje antidepresivov. Pri bolnikih s klinično depresijo so v nižjih koncentracijah. miRNA 124 in 132 so uporabili, ker so številne študije poročale o povečani regulaciji teh miRNA pri bolnikih s klinično depresijo. miRNA so izbrali tudi, ker so dobro raziskane in lahko dostopne iz krvi, seruma in drugih telesnih tekočin.

Razviti so morali dve metodi kvantifikacije - aptasenzorje oziroma FRET aptamerje za serotonin, kortizol in protein Gsα ter magnetne nanosonde, ki se uporabljajo za mikroRNA. Aptasenzor je sestavljen iz aptamera, ki vsebuje fluorofor, in cDNA, na katero je pritrjen dušilec. Medtem ko je cDNA vezana na aptamer, fluoroforji prenašajo energijo na dušilec in fluorescence ni mogoče opaziti. V prisotnosti tarče pa se aptameri FRET vežejo nanjo in izpodrinejo cDNA. Brez dušilca v bližini fluorofor proizvede zaznaven fluorescentni signal. Zasnovana nanosonde pa obsega magnetni nanodelec s pritrjenimi molekularnimi svetilniki, ki prav tako delujejo po principu FRET in proizvajajo fluorescenco preko sistema fluorofor-dušilec. Molekularni svetilniki oziroma sonde molekularnih svetilnikov so enoverižne strukture DNA s tremi vidnimi deli: eden je komplementaren ciljni miRNA, eden je pritrjen na fluorofor in eden je pritrjen na dušilec. Ko je nanosonda inertna, obstaja v lasni strukturi in drži dušilec blizu fluoroforja, tako da ne oddaja signala. Ko se ciljna miRNA veže na sondo, lahko hibridizacija ciljne sonde odpre lasnico in tvori aktivno strukturo "Y". Ta aktivna struktura ločuje fluorofor in dušilec ter oddaja fluorescenco. Zaznavanje miRNA, ki so prisotne v krvi v nižjih koncentracijah, so izboljšali tako, da so molekularne svetilnike pritrdili na magnetne nanodelce in usmerili fluorescenco na manjše območje.

Kvantifikacijski sistemi so vključeni v mikrofluidni čip, ki je izdelan iz polidimetilsiloksana (PDMS), silikonskega polimera. Kot vhod uporablja vzorce človeške krvi.

OASYS je opremljen tudi s sistemom za zaznavanje fluorescence skupaj z mikrofluidnim čipom. Gre za 3D-natisnjeno škatlo, opremljeno z LCD zaslonom, nastavitvijo Arduino UNO in potrebnimi dodatki. Ko je mikrofluidni čip vstavljen v napravo, notranja modra LED svetloba vzbuja vsakega od petih vzorcev, oddano fluorescenco pa zazna drug fotodarlingtonov senzor. Izmerjena intenzivnost fluorescence se nato pretvori v ravni koncentracije biomarkerjev in prikaže na LCD zaslonu, pri čemer vse odčitke podatkov upravlja mikrokrmilnik Arduino UNO. [1]

Eksperimenti v laboratoriju

Magnetne nanosodne

S transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) so pridobili sliko nanodelcev. Veliki so bili v povprečju 12 nm v premer. Z dinamičnim sipanjem svetlobe so pridobili zeta potencial. Na grafu je bil izrisan samo en vrh, kar je nakazovalo na to, da so nanodelci dobro razpršeni v mediju in omogočajo natančne vrednosti zeta potenciala. Zeta potencial je bil -21 milivoltov. Negativni zeta potencial je potrdil, da so karboksilne skupine res prisotne v nanodelcih, vrednost manj kot -20 mV pa dokazuje, da so skupine stabilne. Preverjali so tudi nastanek sonde in vezave miDNA z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu (PAGE). miDNA se je vezala na sondo, vendar je bila razlika v lisah na gelu zelo majhna in težko razvidna. Razlog za to je, da ima miDNA le 22 nukleotidov. Izvajali so tudi eksperimente na osnovi fluorescence z uporabo čitalnika mikroplošč. Preverili so, ali miDNA dejansko povzroči, da se dušilni par fluoroforjev odmakne. Iz grafov je bilo razvidno, da se je intenzivnost fluorescence pri vezavi miDNA v obeh sondah (124 in 132) povečuje, kar dokazuje, da vezava miDNA povzroči, da se zanka odpre in loči fluoroforski dušilni par. Potrdili so tudi, da z vezavo magnetnega nanodelca na sondo (nastanek nanosonde), izboljšajo intenzivnost fluorescence ter, da so nanosonde sposobne zaznave sprememb fluorescence v pikomolarnih ravneh miDNA. To je pomembno, saj je vzorec, ki ga sistem uporablja, miRNA v krvi. Tako netarčna miDNA kot miDNA s samo dvema nukleotidnima razlikama glede na ciljno sekvenco miDNA ni pokazala pomembnega povečanja intenzivnosti fluorescence. Nanosonda 124 je torej zelo specifična za svojo tarčo. Za nanosondo 132 pa niso dobili zanesljivega zaključka. [1]

Aptasenzorji

Z PAGE so želeli potrdili hibridizacijo cDNA in aptamerja, vendar niso dobili jasnih znakov hibridizacije. To bi lahko bila posledici majhnosti aptamerja in cDNA. Edini pas na gelu, ki je bil viden, je bil 85-merni aptamer in kortizol. Hibridizirane komplekse so preverjali tudi z izotermno titracijsko kalorimetrijo. Potrdili so močno povezavo med cDNA 1 in 44-mernim serotoninskim aptamerjem, dobro razmerje med kortizolsko cDNA 1 in 85-mernim aptamerjem, niso pa našli očitne interakcije med cDNA 2 in 44-mernim serotoninskim aptamerjem. Hibridizacijo aptamerjev na cDNA so odkrivali tudi z opazovanjem hitrosti dušenja signala FRET. V primeru, da je pride do ugasnitve signala FRET, gre za uspešno vezavo. Za pridobitev najbolj občutljivega aptamerja, so iskali idealno molsko razmerje. Za to pa so najprej morali določiti najnižjo koncentracijo aptamerja, ki jo je mogoče zaznati v izbranem fluorološkem fluorospektrometru. Za 85-merni kortizolski aptamer in cDNA 1 je bilo ugotovljeno, da je idealno molsko razmerje 1:3 in 1:5; za 85-merni kortizolski aptamer in cDNA 2 pa 1:3. Za posamezne aptamerje in njihova idealna molska razmerje so določili tudi idealen hibridacijski čas. Uporabili so fluorospekter Fluorolog. Da bi preverili specifičnost serotoninskega aptasenzorja, so izvedli test mešanice biomarkerjev. Preverjali so porast fluorescence ob dodatku različnih biomarkerjev, razen serotonina, in mešanice vseh biomarkerjev. Dokazali so, da je serotoninski aptasenzor dobro specifičen, saj je pokazal veliko razliko v fluorescenci. Preizkusi občutljivosti aptasenzorja, pa so vključevali merjenje povečanja fluorescence, po dodatku različnih koncentracij izbranega biomarkerja, ki posnema človeško fiziološko vrednost. Višja kot je občutljivost, manjša je koncentracija biomarkerjev, ki jo je mogoče zaznati. [1]

Gsα protein

Začetni načrti za protein Gsα so vključevali izražanje, čiščenje in kvantifikacijo z aptasenzorji. Nameravali so sintetizirati aptamerje za protein Gsα z uporabo metode SELEX. Pridobili bi aptamerje, ki se specifično vežejo na protein Gsα. Žal jim to zaradi časovnih in proračunskih omejitev ni uspelo. Namesto tega, so se poslužili postopkov kloniranja. Protein so pomnoževali, uspešnost pa potrdili z gradientno PCR. Optimalna temperatura za amplifikacijo je bila 62,5°C. Vizualizacijo so izvedli v UV transiluminatorju, saj niso želeli ogroziti kakovosti eluirane DNA. V vektor pET19b, so želeli vstaviti pomožni vložek, zato so s pomočjo restrikcijskih endonukleaz ustvarili lepljive konce na vstavku in vektorju. Restrikcijska razgradnja je bila izvedena z uporabo BamH1 in Nde1, endonukleazama z visoko stopnjo natančnosti. Uspešnost restrikcije so preverili na agaroznem gelu. Izvedli so še ligacijsko reakcijo z reverznim in povratnim primerjem in T4 DNA ligazo, kar pa ni prineslo želenega rezultata. Ko so izvedli nadaljnje poskuse transformacije, so našli 2 koloniji. Izdelali so glavno ploščo in izvedli kolonijski PCR. Ponovno so dobili nezadovoljive rezultate. Zaradi časovne omejitve niso mogli nadaljevati z odpravljanjem težav s protokolom in nadaljnjimi poskusi za Gsα. [1]

Prihodnost

Kot že omenjeno, nekaterih poskusov niso mogli dokončati zaradi finančni in časovnih omejitev. V želji po nadaljevanju, so naredili načrt financiranja in komercializacije projekta. Sami bi želeli opraviti dodatne temperaturne teste za aptasenzorje, ter izraziti in očistiti protein, kot so imeli načrt na začetku. Želeli bi se tudi vključiti v klinične študije. Za izboljšanje točnosti in specifičnosti kvantifikatorjev v krvi, bi potrebovali dostop do vzorcev krvi, za uporabo teh pa je potrebna predhodna odobritev etične komisije. [1]

Literatura

[1] OASYS. IISER-TMV iGEM 2023. https://2023.igem.wiki/iiser-tvm/home (pridobljeno 12.5.2024)