Podenote E3 ligaznega kompleksa kot degroni za učinkovito degradacijo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov

Izhodiščni članek: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins

Razgradnja proteinov s proteosomom

Večina proteinov v sesalskih celicah se razgradi skozi ubikvitin-proteosomsko pot, ki omogoča negativno kontrolo aktivnosti proteinov. Na lizinske ostanke kovalentno vezani ubikvitini (Ub) služijo, kot signal za 26S proteosom, ki vodi v razgradnjo označenega proteina. Ubikvitinska post-translacijska modifikacija katalizira encimska kaskada, katero sestavljajo proteini E1, E2 ter E3.

E1 ali ubikvitin-aktivacijski protein ob porabi ATP-ja katalizira prvi korak ubikvitinacijske reakcije, tako da aktivira Ub s tvorbo tioesterske vezi s C-koncem Ub. Aktiviran Ub se prenese na ubikvitinski nosilec E2. Tako nastali intermediat E2-Ub interagira z ubikvitin ligazo ali E3, ki katalizira prenos Ub z E2 ter tvorbo nove izopeptidne vezi na lizinskemu ostanku substrata (tarčnega proteina). Za razgradnjo označeni substrati so nato razgrajeni s strani proteosoma.

E3 ligaze služijo kot ključni regulatorji ubikvitin-proteosomske poti, saj kontrolirajo specifičnost in učinkovitost prenosa Ub. Dokaz izredne specifičnosti E3 ligaz je dejstvo, da poznamo preko 600 različnih encimov te vrste. Večina človeških E3 ligaz je tipa RING (ang. really interesting new gene), ki omogočajo direkten prenos Ub iz E2 na substrat brez tvorbe E3-Ub intermediata.

Sesalske E3 ligaze

Primer RING ligaze je sesalski SCF-Skp2 E3 ligazni kompleks, ki je strukturno dobro okarakteriziran. Sestavljajo ga protein cullin 1 (Cul 1), ki deluje kot ogrodje, na katerega se nalagajo drugi proteini - protein Rbx1 (ang. RING-box protein 1), ki se veže na C-konec Cul1, in Skp1 (ang. S-phase kinase-associated protein 1), ki se veže na N-konec Cul1. Medtem ko Rbx1 omogoča izmenjavo E2-Ub intermediata preko domene RING, Cul1 umesti substrat in E2-Ub v optimalno prostorsko orientacijo za prenos Ub.

Specifičnost E3 ligaz je dodatno okrepljena z vezavo specifičnih adapterskih proteinov, kot je na primer Skp1. Skp1 vezavo drugih proteinov z motivom F škatle (Skp2). Medtem ko je N-konec F-škatle ohranjen in omogoča interakcijo z E3 ligazo, je C-konec manj ohranjen, pri čemer s s posledično večjo sekvenčno in konformacijsko variabilnostjo omogoča vezavo vrste različnih substratov.

Tarčna razgradnja preko genskih fuzij z E3 ligazo

Ključen dejavnik uspešnosti prenosa Ub ter nalaganje le-tega in tvorbe poliubikvitinske verige je medsebojna bližina med substratom in E2-Ub. Da bi preverili vpliv bližine substrata in E2, so pripravili genetske fuzije reporterskega proteina luciferaze, ki je služila kot substrat, in ubikvitin konjugirajoči encim E2 R1 (CDC34 E2), ki asociira s SCF (ime izvira iz začetnic Skp, Cul in F-škatla) družino E3 ligaz ter dokazano katalizira nastanek na lizin povezanih poliubikvitinskih verig.

Asociacija substrata s podenotami kompleksa E3 ligaze je prav tako povezana z uspešnostjo razgradnje tarčnega proteina. Da bi raziskali, kako vezava posameznih podenot vpliva na razgradnjo substrata so z luciferazo genetsko združili domene E3 ligaznega kompleksa (F-škatlo Skp2, Skp1, Rbx1 in C-terminalni konec Cul1). Fuzije luciferaze in podenot SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa so vodile v manjšo raven luciferazne aktivnosti, kar pomeni, da fuzijski konstrukti negativno vplivajo na učinkovitost razgradnje proteinov. Zmanjšano aktivnost luciferaze zaznamo tudi pri vzorcih, kjer sta združena substrat in E2. Najmanjšo aktivnost luciferaze so kazali vzorci s fuzijo substrata in Cul1 ter substrata in F-škatle.

F-škatla, ki se nahaja tudi v proteinu Skp2 je ključna za interakcijo s Skp1 ter nadaljnjo razgradnjo substrata. Skp1 in Skp2 interagirata preko štirih C-terminalnih vijačnic, Da bi dodatno povečali sposobnost razgradnje proteinov s strani Skp1 so uvajali mutacije in odstranjevali povezovalne vijačnice ter pokazali, da je aktivnost luciferaze najnižja v vzorcih, kjer ima Skp2 le eno C-terminalno vijačnico.

Rbx1 se z beta-ploskvijo veže na Cul1, delecije v tej regiji so vodile v povečanje aktivnosti luciferaze v primerjavi z vzorcem brez mutacije. Beta-ploskev Rbx1 očitno vpliva na učinkovitost destabilizacije substrata. Podenote kompleksa SCF-Skp2 E3 lahko delujejo kot degroni – minimalni elementi v proteinu, ki omogočajo tarčenje substrata za ubikvitinsko-proteosomsko mediirano razgradnjo.

Preiskovanje posameznih degronov

Za preiskovanje posameznih degronov in povezovanje degronov in substrata so uporabili heterodimere obvitih vijačnic (CC). To so strukturni motivi- supervijačnice tipično v obliki dimerov ali trimerov. Dejansko jih lahko sestavlja do 7 alfa-vijačnic. So eden od proteinskih motivov, kjer je odnos med sekvenco in strukturo do velike mere že določen. Omogočajo načrtovanje in sestavljanje modularnih proteinov, ki se odzivajo na pričakovan način.

Zaradi predvidljivega obnašanja CC so te zelo uporabne za zagotavljanje povezanosti določenih proteinov ali proteinskih domen. Da bi preučili posamezne degrone in zagotovili povezanost degronov s substratom (luciferazo) so pripravili genetske fuzije CC s substrati in degroni. Vijačnici v obeh genetskih fuzijah sta si komplementarni oz. imata afiniteto druga z drugo. Uspešna interakcija CC substrata in degrona povzroči padec aktivnosti luciferaze, s tem da se aktivnost luciferaze dodatno zmanjša pri parih CC z nižjimi afinitetami.

Prostorska orientacija substrata glede na ligazni kompleks je izredno pomembna, zato je učinkovitost razgradnje substrata odvisna od rigidnosti povezovalnega zaporedja med CC in proteinom ter med CC in degronom. Povezovalna zaporedja so fleksibilna. Sestavljena so iz glicinskih in serinskih ponovitev, njihova optimalna dolžina pa je odvisna glede na tip degrona. V splošnem so daljša povezovalna zaporedja med substratom in CC vodila v večjo raven razgradnje. Daljša povezovalna zaporedja med CC in degronom pa so vodile v manjšo raven razgradnje. Fleksibilnost substrata, prav tako kot rigidnost degrona izboljša procesivnost ligaze.

Literatura

[1] A. Verbič, T. Lebar, A. Praznik, R. Jerala: Subunits of an E3 Ligase Complex as Degrons for Efficient Degradation of Cytosolic, Nuclear, and Membrane Proteins. ACS Synth Biol 2024, 13, 792–803. [2] A. L. Boyle: Applications of de novo designed peptides. Peptide Applications in Biomedicine, Biotechnology and Bioengineering 2018, 51–86.