Optogenetsko prostorsko vzorčenje kooperacije pri glivah kvasovkah: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
No edit summary
No edit summary
Line 1: Line 1:
Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-023-44379-5 Optogenetic spatial patterning of cooperation in yeast populations]
Izhodiščni članek: [https://link.springer.com/article/10.1007/s11307-023-01879-6 Reprogramming a Doxycycline-Inducible Gene Switch System for Bacteria-Mediated Cancer Therapy]




== Uvod ==
== Uvod ==
V mikrobioloških kolonijah je vedno prisotna kompeticija za hrano ter prostor. Pri določenih mikrobih in mikrobiomih pa so prisotni procesi ki omogočajo kooperacijo med celicami. Eden izmed teh primerov je prisoten pri glivi kvasovki (''S. cerevisiae'') kjer imajo celice prisoten encim SUC2p invertazo. Te celice imenujemo kooperatorji. Ta encim omogoča celicam razgradnjo saharoze na glukozo in fruktozo (heksoze) ki predstavljata vir hrane za celice v okolici. Hidroliza saharoze poteka v periplazemskem prostoru. Večina produktov se izloči iz celice nekaj pa jih porabi kooperator kot vir hrane. Nekatere glive kvasovke pa nimajo prisotnega gena za invertazo in tako ne morejo hidrolizirati saharoze. Te, tako imenovane, goljufive celice so v celoti odvisne od kooperatorskih celic za vir hrane. Raziskovalci so hoteli določiti velikosti domen kooperatorjev in goljufivih kvasovk kjer kooperacija poteka optimalno in tako omogoča optimalno rast kvasovk ter proizvodnjo encima [1-3].
Oslabljena Salmonella typhimurium lahko tvori kolonije znotraj tumorja in inhibira njegovo rast. V študiji, ki so jo izvedli Ngo in sodelavci so želeli razviti z doksiciklinom inducibilno gensko stikalov v oslabljeni S. typhimurium in raziskati njegovo terapevtsko učinkovitost na mišjih modelih. S. typhimurium je uporabna zaradi svoje nizke sistemske toksičnosti in selektivne kolonizacije v tumorjih, kar vodi do pomanjkanja kisika, hranil in protitumorskega imunskega odziva. Bakterije lahko genetsko spremenimo, da izražajo terapevtske gene, ki povečajo njihovo proti tumorsko delovanje. Pri tem je za maksimalno učinkovitost pomembno, da načrtujemo kdaj je najbolj optimalno, da se začne izražati terapevtski gen. Običajno to nastopi 1-3 dni po administraciji bakterij. Inducibilni promotorji, zlasti Ptet so uporabni za bakterijsko posredovano terapijo (BCT). Ptet izstopa zaradi njegove sposobnosti, da inducira ekspresijo genov že pri nizkih koncentracijah doksiciklina. Enostavno prehaja bakterijsko membrano in ima primeren razpolovni čas za in-vivo aplikacije (18 ur) [1].
Z razvojem sintezne biologije so se razvila tudi genetska vezja, katerih namen je imeti nadzor nad močjo in časom izražanja tarčnega gena, glede na vhodni signal [1, 2]. V študiji so za induciranje izražanja genov uporabili mestno specifično rekombinacijo, imenovano gensko stikalo. V študiji so ustvarili z doksiciklinom inducibilno gensko stikalo, iz dveh plazmidov. Prvi je nosil zapis za rekombinazo FimE pod nadzorom promotorja Ptet, drugi pa terapevtske gene navzdol od konstitutivnega promotorja z dvema inverznima ponovitvama. Tovorna gena sta bila bioluminiscenčni reporter Rluc8 in bakterijski toksin citolizin A (ClyA). Sistem so transformirali v S. typhimurium CNC018, ki ima prekinjene dve gruči genov imenovanih Salmonella patogeni otočki (SPI-1 in SPI-2). Učinkovitost genskega stikala so preverili v transformiranih CNC018, njegovo proti tumorsko učinkovitost pa v miškah, ki so nosile tumorje CT26 in MC28 (povzroča raka na črevesju [3])[1].  


== Metoda za detekcijo kooperacije ==
== Izvedba ==
Za analizo kooperacije med kooperatorskimi in goljufivimi celicami so uporabili optogenetiko. Metoda temelji na uporabi svetlobe za aktivacijo celic. Ta tehnika se uporablja v nevrologiji za identifikacijo funkcije nevronov v možganih ter za zdravljenje možganskih motenj. V tem primeru so uporabili genetsko modificirane kvasovke ki so sintetizirale SUC2p encim ob prisotnosti modre svetlobe. Za primerjavo kooperacije/kompeticije celic so izvedli več poskusov kjer so spreminjali osvetljeno območje ter intenziteto svetlobe [1,4,5].
Za analizo kooperacije med kooperatorskimi in goljufivimi celicami so uporabili optogenetiko. Metoda temelji na uporabi svetlobe za aktivacijo celic. Ta tehnika se uporablja v nevrologiji za identifikacijo funkcije nevronov v možganih ter za zdravljenje možganskih motenj. V tem primeru so uporabili genetsko modificirane kvasovke ki so sintetizirale SUC2p encim ob prisotnosti modre svetlobe. Za primerjavo kooperacije/kompeticije celic so izvedli več poskusov kjer so spreminjali osvetljeno območje ter intenziteto svetlobe [1,4,5].


== Genske modifikacije ==
Oslabljeno S. typhimurium so pripravili s prekinitvijo genov relA in spoT ter popolno delecijo gruče genov SPI-1 in SPI-2, ki so odgovorni za invazijo bakterije v gostiteljsko celico ter razmnoževanje v le-tej. Bakterijo so transformirali z elektroporacijo in gojili na LB agarnih ploščah z ampicilinom in/ali kloramfenikolom.
Goljufivim celicam so vstavili konstitutiven promotor ter zapis za svetlobno občutljiv transkripcijski faktor EL222 (∆SUC2 celice). Kooperativne celice pa so pred SUC2 gen pridobile pC120 promotor, ki je svetlobno inducibilen ter odvisen od EL222. Ta zapis so združili s zapisoma za P2A ter YFP (yPH_471 celice). YFP zapis je reporter da se SUC2p invertaza sintetizira, P2A sekvenca pa omogoča ločen nastanek invertaze ter fluorescenčnega reporterja (ni fuzije proteinov) [1].  
Plazmid NIA3, ki nosi gen za rekombinazo FimE so s PCR pomnožili z in brez oznake Flag. Očiščene fragmente so rezali z SpeI in StuI in ligirali v plazmid pJH18, ki nosi odpornost za ampicilin. Dobljena plazmida so imenovali pJHFimTag in pJHFimNoTag. Obe verziji sta bili pod nadzorom PtetA v Ptet dualnem promotorju. Kot tarčo za rekombinacijo so načrtali DNA zaporedje močnega konstitutivnega promotorja POXB20, z inverznimi ponovitavmi na levem in desnem koncu. Fragment so pomnožili s tremi PCR reakcijami in končni produkt poimenovali OXB20 stikalni blok. Rluc8 gen so pomnožili tako, da je nosil zapis za oznako His. OXB20 stikalni blok in Rluc8 so ligirali v plazmid pTU2S. Dobljen plazmid imenovan p15AOXBR je nosil zapis za odpornost na kloramfenikol. Zapis za clyA gen so pripravili z oznako Myc in ligirali v plazmid p15AOXBR, dobljeni plazmid pa poimenovali p15AOXBC. Zapisa za Rluc8 in ClyA sta bila pod obrnjenim promotorjem. Eden izmed plazmidov, ki nosi zapis za FimE (pJHFimTag ali pJHFimNoTag) in plazmid p15AOXBR so kotransformirali v bakterije CNC018. Kot kontrolo na Doxy – inducibilno stikalo so pripravili CNC018 bakterije, transformirane s pJH18-Rluc8(AP), pJH18-Rluc(RP) ali pJH19-ClyA(AP). V teh konstruktih je bil Rluc8 gen pod nadzorom promotorjev PtetA in Ptet, clyA gen pa pod promotorjem Ptet. Transformirane celice so preko noči gojili na 37 °C, jih razredčili v svežem LB mediju in nato gojili do srednje log faze, kjer so dodali različne koncentracije doksiciklina (0-500 ng/mL).
Za preučevanje distribucije bakterij uporabili miške, ki so jim injicirali CT26 celice. Aplikacija je bila subkutana na desni bok. Ko je tumor dosegel velikost 80-120 mm3 so intravenozno injicirali CNC018 ali ΔppGpp bakterije. Ko je tumor dosegel 150 mm3 so intravenozno injicirali CNC018::pFimTagOXBR ali CNC018::pJH18-Rluc8(AP) bakterije. Prejele so oralno administracijo doksiciklina (1,7 mg/kg telesne teže) 1, 2 ali 3 dni po injiciranju z bakterijami. Za ugotavljanje proti tumorske aktivnosti Doxy – inducibilnega clyA stikala so uporabili CT26 in MC38 tumorske celice, ki so jih subkutano implementirali v ženske miške stare 6 tednov. Kot kontrolo si CNC018::pJH18-ClyA intravenozno injicirali v miške z mutacijo CT26.


Divji tip ter ∆SUC2 celice pod svetlobo niso imele dovolj visoke encimske aktivnosti za nadaljnjo delo, yPH_471celice pa so imele bolj intenziven odziv v obliki tvorbe invertaze kot divji tip. Kljub temu so bile potrebne modifikacije saj so ∆SUC2 celice imele slabšo rast od divjega tipa ter yPH_471 celice so imele boljšo rast od ∆SUC2 tudi ob odsotnosti svetlobe. Dolgotrajna obstojnost SUC2p proteina je verjetno povzročalo puščanje pC120 promotorja kar je vodilo v akumulacijo proteina v periplazemskem prostoru [1].
== Rezultati ==
 
Doxy - inducibilno stikalo je bilo sestavljeno iz dveh plazmidov. pJHFimTag, ki nosi ColE1 ori in odpornost na ampicillin. Kodira za represor TetR pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja POXB1 in FimE z oznako Flag pod promotorjem PtetA. Za inverzijo je zadostna že nizka količina FimE, zato so odstranili RBS pred ORF. Drugi plazmid, ki je imel tarčo za rekombinacijo (p15AOXBR z Rluc8 ali p15AOXBR z clyA) je prisoten v nizkem številu kopij, nosi p15A ori, odpornost na kloramfenikol in OXB20 stikalni blok, ki ima močan konstitutivni promotor POXB20 s tarčnimi zaporedji za rekombinazo na obeh koncih. Preiskovana gena (GOI) sta bila na nasprotni strani POXB20. Ekspresijo so inducirali z dodatkom doksiciklina. Ob odsotnosti le-tega se je konstitutivno izražal TetR, kar je inhibiralo ekspresijo fimE gena. Ob prisotnosti le tega pa se doksiciklin veže na TetR in se sprosti s Ptet, kar inducira izražanje fimE, to pa inducira rekombinacijo OXB20 stikalnega bloka z POXB20 tako, da se usmeri proti GOI.
Z namenom zmanjšanja puščanja so genski zapis nadaljnjo modificirali tako da so zmanjšali število vezavnih domen na pC120 promotorju ter dodali lasnico za hitrejšo degradacijo mRNA SUC2 gena. V določene celice so vstavili obe spremembi (yPH_540) v druge pa samo zapis za lasnico (yPH_536) ter njihove kolonije obsevali s svetlobo. yPH_536 kvasovke so imele najboljše rezultate v razliki rasti med prisotnostjo in odsotnostjo svetlobe zato so v nadaljnjih poskusih uporabljali te celice [1].  
Funkcionalnost genetskega stikalo so ocenili z merjenjem bioluminescence, ki jo je generiral Rluc8. Bioluminiscenca se je povečala v odvisnosti od dodanega doksiciklina v prvih 18 urah nato pa se malo zmanjšala. Signal je bil precej višji v kolonijah, ki so bile transformirane s pGimTagOXBR v primerjavi s pFimNoTagOXBR, kar so pripisali temu, da se fimE gen z oznako bolje izraža. Da so izmerili v kolikšni meri je potekla rekombinacija so izvedli analizo z PCR. Uporabili so specifične primerje, ki bi morali delovati samo v primeru, ko je potekla rekombinacija (ON stanje). Pričakovanih fragmentov niso zaznali v bakteriji, kjer je bila koncentracija dodanega doksiciklina manj kot 5 ng/mL, kar pomeni da je bilo puščanje promotorja zanemarljivo majhno. Signifikantna meja detekcije je bila pri 20 ng/mL za CNC::pFimTagOXBR in 100 ng/mL pri CNC:pFimNoTagOXBR. Rezultati prenosa Western so bili konsistenti s tistimi dobljenimi pri bioluminiscenci in PCR.
 
===Genetska stabilnost rekombinacije===
== Optocube ==
FimE inducira enosmerno inverzijo gena, ki ima na robu inverzne ponovitve, rekombinaza namreč prepozna IRR bolj učinkovito kot IRL. Rekombinacija gena se zato ohranja in je dedna. Prenos Doxy – inducibilnega stikala so preverili z uporabo CNC018:pFimTaxOXBR bakterij, ki so jih inducirali z različnimi koncentracijah doksiciklina, jih gojili v prisotnosti le-tega 18 ur nato pa 3 dni gojili brez prisotnosti doksiciklina. Ekspresijo Rluc8 so ocenili s prenosom Western. Šibka lisa se je pojavila pri bakterijah, ki so prvotno rastle z doksiciklinom s koncentracijo 100 ng/mL in je naraščala s koncentracijo do 500 ng/mL. Pri koncentracijah pod 300 ng/mL je bila raven ekspresije Rluc8 po 18 urah inkubacije z doksiciklinom višja kot v kulturah odvzetih po treh dneh, kar so pripisali nepopolni rekombinaciji pri nižjih koncentracijah doksiciklina. Pri koncentraciji 500 ng/mL pa je bila rekombinacija stabilno ohranjena vsaj 3 dni.  
Kolonije kvasovk so rasli na trdih agarjevih gojiščih saj je tako bilo lažje meriti tvorbo SUC2p invertaze ter analizirati kooperacijo kot v tekočih gojiščih. V tekočih gojiščih je zaradi celične rasti prišlo do izrivanja kooperatorjev iz osvetljenih območij. Poleg tega je bila sposobnost tvorbe encima v teh izrinjenih celicah še vedno prisotna kar je onemogočilo določitve meje med kooperatorji in goljufivimi celicami. Povsod so celice najprej stradali preden so jih prenesli na gojišče z 1% saharoze. Specifično so celice kvasovke nanesli na gojišče ki je na površini imelo plast s 0,5% agaroze pod tem pa se je nahajal fitagel s saharozo [1].  
===Biodistribucija CNC018 bakterij v CT26 miškah===
 
Prisotnost bakterij CNC018 in ΔppGpp so preverjali v tumorju, jetrih, vranici in krvi s kvantificiranjem viabilnih bakterijskih populacij 1, 2, 3 in 5 dni po administraciji. Oba seva sta pokazala močno prisotnost znotraj tumorja od prvega dne. Signifikantni delež ΔppGpp je bil zaznan v jetrih in vranici 1 in 2 dan, CNC018 pa niso bile prisotne v teh tkivih nad mejo detekcije (1x103 CFU). 1 dan po injiciranju v krvi niso zaznali niti CNC018, niti ΔppGpp. Prav tako so pokazali, da se lahko Doxy – inducibilni sistem v sevu CNC018 inducira že prvi dan aplikacije.
Za pridobitev najboljših rezultatov so naredili tako imenovan OptoCube. To je temperaturno nadzorovana komora kjer so lahko natančno obsvetili agarske plošče s  poljubnimi intenzitetami ter vzorci svetlobe. Plošče so skenirali znotraj inkubatorja ter analizirali rast celic ter tvorbo invertaze. Na osvetljenih območij so se pojavile kolonije celic ki so bile zmožne hidrolize saharoze (kooperatorske celice), v zatemnjenih območij pa so se tvorile kolonije goljufivih celic ki niso tvorile SUC2p invertaze (vse kvasovke tipa yPH_536). Zaradi nesposobnosti tvorbe virov hrane so goljufive kvasovke bile odvisne od heksoz ki jih kooperatorji izločijo po hidrolizi saharoze. Največja rast v zatemnjenih območij je bila zato na meji z osvetljenimi območij saj je bilo tam prisotnih največ produktov hidrolize. Kot je bilo predvideno je bolj intenzivna svetloba omogočala hitrejšo rast kvasovk saj se je tvorilo več encima ter tako potekalo več hidrolize saharoze iz gojišča kar je tvorilo več heksoz. Tvorba encima tako tudi vpliva na rast kvasovk. Največja rast je bila prisotna med 10 in 40 urami vendar različno hitro glede na intenziteto svetlobe. Na ploščah ni bilo prisotnega drugega vira hrane [1].  
Za tarčenje tumorja transformiranih bakterijskih celic so CNC018:pFimTagOXBR intravenozno injicirali v CT26 miške. Bioluminiscence niso zaznali 3 dni v miškah, ki niso dobile doksiciklina. Miši, ki so dobile doksiciklin 1, 2 ali 3 dni po administraciji so imele merljiv signal znotraj tumorja in so dosegle maksimum 2-3 dni po indukciji z doksiciklinom. Maksimalni signal je bil višji pri miših, ki so dobile doksiciklin 1 ali 2 dan. Glede na kontrolo so zaključili, da se bakterije z Doxy – inducibilnim stikalom lokalizirajo v tumorsko tkivo znotraj dveh dni po intravenozni aplikaciji in da je indukcija z doksiciklinom 1 ali 2 dni po injekciji optimalna za rekombinacijo.
 
===Proti tumorski učinek transformiranih bakterij===
Za boljšo interpretacijo rezultatov so uporabili Michaelis-Menten enačbe ter Monod enačbo za računanje stopnje encimske reakcije in rast na podlagi koncentracije metabolitov hidrolize [1]. 
In vivo protitumorski efekt CNC::pFimTagOXBC so okarakterizirali z uporabo konstrukta, ki je nosil pJHFimTag za izražanje FimE in p15AOXBC za izražanje ClyA. ClyA niso zaznali v odsotnosti doksiciklina, nizke koncentracije proteina pa so zaznali pri koncentraciji 5 ng/mL doksiciklina. Hemolitično aktivnost bakterije so ocenili z gojenjem na krvnem agarju v prisotnosti različnih koncentracij doksiciklina. Kolonije s hemolitičnimi conami so se pojavili na ploščah s koncentracijo 5 ng/mL, število pa je naraščalo z naraščajočo koncentracijo. ClyA se torej funkcionalno izraža po rekombinaciji.  
 
Protitumorski efekt so ocenjevali v BALB/c miškah z CT26 tumorji. Doksiciklin so oralno administrirali 1, 2 ali 3 dni po injiciranju bakterij. Miši, ki so tretirali z bakterijami v odsotnosti doksiciklina (brez indukcije) so imele signifikantno supresijo tumorja v primerjavi z netretiranimi mišmi. Supresivni efekt pa se je povečal v vseh skupinah, kjer je potekla indukcija, najopaznejša pa je bila v prvi skupini (indukcija 1 dan po aplikaciji bakterij). 51 dan so opazili popolno uničenje tumorja v skupinah, ki so bile inducirane z doksiciklinom (83%, 75% in 58% v vsaki skupini). Podobne protitumorske efekte so opazili tudi pri miših s tumorji MC38.
== Domene kooperacije in kompeticije ==
V naslednjem koraku so obsvetili agarske plošče s homologno svetlobo različnih širin. Po določenem času se je na osvetljeni površini pojavil nehomogen biofilm. Na širših območji  je večino kooperatorjev zraslo na obrobnih območij osvetljenega območja najverjetneje ker je bilo tam največ saharoze iz zatemnjenih območij. Širše ko je bilo osvetljeno območje manjša je bila gostota kooperatorjev na sredini tega območja. Ponovno lahko ta pojav razložimo s difuzijo saharoze saj ta rabi dlje časa da potuje do sredino osvetljenega območja kjer jo kooperatorji lahko porabijo. Kooperatorske celice tekmujejo za saharozo. Zato, ko je tam vsa saharoza porabljena kvasovke proizvedejo manj encima in je prisotna manjša količina heksoz. Gostota goljufivih celic pa se je povečevala. Goljufive kvasovke pa niso sposobne proizvesti encima ker niso osvetljene zato saharoza difundira v osvetljeno območje. Tudi gostota goljufivih celic je največja  na obrobnih območij saj je tam največje koncentracija heksoz ki za te kvasovke predstavljajo vir hrane. Tu je prisotna kompeticija goljufivih celic [1].
 
V zadnjem koraku pa so želeli vedeti meje osvetljenih domen na petrijevkah kjer še ne bi prišlo do kompeticije med kooperatorji in kompeticije med goljufivimi kvasovkami. Gojišča so obsevali s svetlobo določene širine ter merili gostoto celic. Ugotovili so da je gostota kooperatorjev ter goljufivih kvasovk odvisna od širine osvetljenih ter zatemnjenih območij. Določili so da je na osvetljenih območij širine 5 mm ali manj prišlo do kompeticije goljufivih celic saj je bilo premajhno število kooperatorjev ki so lahko proizvajali vir hrane (heksoze). Zato so bile celice v kompeticiji za hrano in je najvišja gostota celic bila ob mejnih območij osvetljenega območja. Pri zelo ozko osvetljenih območij pa ni bilo mogoče razlikovati med kooperatorskimi in goljufivimi kvasovkami (meja ni bila vidna) [1].  
 
Na drugi strani pa so ugotovili da je na osvetljenih območij širine 20 mm ali več prišlo do kompeticije med kooperatorskimi celicami. Ponovno je po določenem času zmanjkalo saharoze v gojišču in v osrednjem območju svetlobne domene saharoza z difuzijo ni prišla saj so jo prej hidrolizirali drugi kooperatorji. Tako tudi ni bilo prisotnih veliko heksoz. To je zato omejevalo rast kvasovk v sredini osvetljene domene. Največja gostota kooperatorskih kvasovk je ponovno bila na mejnih območij [1].  
 
Na podlagi tega so ugotovili da je rast kooperatorjev in goljufivih celic najboljša ko je območje kooperatorjev široko med 5 in 20 mm (osvetljeno območje). Drugače pride do kompeticije. Tu lahko naredimo analogijo s pasovno prepustnim filtorm kjer samo ponavljajoča se osvetljena območja določene širine med katerimi je določena razdalja (določene »frekvence osvetlitve«) lahko omogočajo primerne pogoje za rast kooperatorskih in goljufivih celic [1].  


== Zaključek ==
== Zaključek ==
Z uporabo optogenetike so lahko z uporabo SUC2p invertaze določili pogoje pri katerih pride do kooperacije ter kdaj do kompeticije med glivam kvasovkam. Gensko modificirane kvasovke so nanesli  na agarske plošče v OptoCube kjer jim je bilo omogočeno optimalno izražanje encima (tvorba biofilma). S pomočjo svetlobe jim je tako bilo omogočeno razumevanje spremembe metabolizma encima v kvasovkah ter kako količina tega vpliva na rast celic. Ta metoda in način poskusa bi lahko bilo nadaljnjo uporabno za analizo kooperatorskih ter kompeticijskih mehanizmov v drugih mikroorganizmih ter mikrobiomih. Prav tako to predstavlja način optimizacije pogojev gojenja za različne laboratorijske mikroorganizme in encimov ter raziskav človeških bolezni na koži ter posledičnih bolezni zaradi nenormalnosti človeškega mikrobioma [1].  
Sistem je omogočal nadzor nad ekspresijo tarčnega gena po enkratni administraciji doksiciklina. Učinkovitost je bila ocenjena in vitro in in vivo, kjer so potrdili, da je uspešen pri supresiji rasti tumorja v miših.


== Literatura ==
== Literatura ==


[1] M. L. Bec, S. Pouzet, C. Cordier, S. Barral, V. Scolari, B. Sorre, A. Banderras, P. Hersen: Optogenetic spatial pattering of cooperation in yeast populations. Nature Communications, 2024, 15(75), str. 1-14
[1] H. T.-T. Ngo, D.-H. Nguyen, S.-H. You, K. Van Nguyen, S.-Y. Kim, Y. Hong, J.-J. Min: Reprogramming a Doxycycline-Inducible Gene Switch System for Bacteria-Mediated Cancer Therapy. Mol Imaging Biol 2024, 26, 148–161.
 
[2] N. Raj, S. Saini: Maintenance of cooperation in a yeast population in a public-good driven system. bioRxiv, 2023, str. 1-20.
 
[3] R. C. MacLean, I. Gudelj: Resource competition and social conflict in experimental populations of yeast. Nature, 2006, 441, str. 498-501.


[4] S. C. P. Williams, K. Deisseroth: Optogenetics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(41), str. 16287.
[2] J. A. N. Brophy, C. A. Voigt: Principles of genetic circuit design. Nat Methods 2014, 11, 508–520.


[5] E. S. Boyden: Optogenetics and the future of neuroscience. Nature Neuroscience, 2015, 18, str. 1200–1201.
[3] T. Taniura, Y. Iida, H. Kotani, K. Ishitobi, Y. Tajima, M. Harada: Immunogenic chemotherapy in two mouse colon cancer models. Cancer Science 2020, 111, 3527–3539.

Revision as of 05:25, 20 May 2024

Izhodiščni članek: Reprogramming a Doxycycline-Inducible Gene Switch System for Bacteria-Mediated Cancer Therapy


Uvod

Oslabljena Salmonella typhimurium lahko tvori kolonije znotraj tumorja in inhibira njegovo rast. V študiji, ki so jo izvedli Ngo in sodelavci so želeli razviti z doksiciklinom inducibilno gensko stikalov v oslabljeni S. typhimurium in raziskati njegovo terapevtsko učinkovitost na mišjih modelih. S. typhimurium je uporabna zaradi svoje nizke sistemske toksičnosti in selektivne kolonizacije v tumorjih, kar vodi do pomanjkanja kisika, hranil in protitumorskega imunskega odziva. Bakterije lahko genetsko spremenimo, da izražajo terapevtske gene, ki povečajo njihovo proti tumorsko delovanje. Pri tem je za maksimalno učinkovitost pomembno, da načrtujemo kdaj je najbolj optimalno, da se začne izražati terapevtski gen. Običajno to nastopi 1-3 dni po administraciji bakterij. Inducibilni promotorji, zlasti Ptet so uporabni za bakterijsko posredovano terapijo (BCT). Ptet izstopa zaradi njegove sposobnosti, da inducira ekspresijo genov že pri nizkih koncentracijah doksiciklina. Enostavno prehaja bakterijsko membrano in ima primeren razpolovni čas za in-vivo aplikacije (18 ur) [1]. Z razvojem sintezne biologije so se razvila tudi genetska vezja, katerih namen je imeti nadzor nad močjo in časom izražanja tarčnega gena, glede na vhodni signal [1, 2]. V študiji so za induciranje izražanja genov uporabili mestno specifično rekombinacijo, imenovano gensko stikalo. V študiji so ustvarili z doksiciklinom inducibilno gensko stikalo, iz dveh plazmidov. Prvi je nosil zapis za rekombinazo FimE pod nadzorom promotorja Ptet, drugi pa terapevtske gene navzdol od konstitutivnega promotorja z dvema inverznima ponovitvama. Tovorna gena sta bila bioluminiscenčni reporter Rluc8 in bakterijski toksin citolizin A (ClyA). Sistem so transformirali v S. typhimurium CNC018, ki ima prekinjene dve gruči genov imenovanih Salmonella patogeni otočki (SPI-1 in SPI-2). Učinkovitost genskega stikala so preverili v transformiranih CNC018, njegovo proti tumorsko učinkovitost pa v miškah, ki so nosile tumorje CT26 in MC28 (povzroča raka na črevesju [3])[1].

Izvedba

Za analizo kooperacije med kooperatorskimi in goljufivimi celicami so uporabili optogenetiko. Metoda temelji na uporabi svetlobe za aktivacijo celic. Ta tehnika se uporablja v nevrologiji za identifikacijo funkcije nevronov v možganih ter za zdravljenje možganskih motenj. V tem primeru so uporabili genetsko modificirane kvasovke ki so sintetizirale SUC2p encim ob prisotnosti modre svetlobe. Za primerjavo kooperacije/kompeticije celic so izvedli več poskusov kjer so spreminjali osvetljeno območje ter intenziteto svetlobe [1,4,5].

Oslabljeno S. typhimurium so pripravili s prekinitvijo genov relA in spoT ter popolno delecijo gruče genov SPI-1 in SPI-2, ki so odgovorni za invazijo bakterije v gostiteljsko celico ter razmnoževanje v le-tej. Bakterijo so transformirali z elektroporacijo in gojili na LB agarnih ploščah z ampicilinom in/ali kloramfenikolom. Plazmid NIA3, ki nosi gen za rekombinazo FimE so s PCR pomnožili z in brez oznake Flag. Očiščene fragmente so rezali z SpeI in StuI in ligirali v plazmid pJH18, ki nosi odpornost za ampicilin. Dobljena plazmida so imenovali pJHFimTag in pJHFimNoTag. Obe verziji sta bili pod nadzorom PtetA v Ptet dualnem promotorju. Kot tarčo za rekombinacijo so načrtali DNA zaporedje močnega konstitutivnega promotorja POXB20, z inverznimi ponovitavmi na levem in desnem koncu. Fragment so pomnožili s tremi PCR reakcijami in končni produkt poimenovali OXB20 stikalni blok. Rluc8 gen so pomnožili tako, da je nosil zapis za oznako His. OXB20 stikalni blok in Rluc8 so ligirali v plazmid pTU2S. Dobljen plazmid imenovan p15AOXBR je nosil zapis za odpornost na kloramfenikol. Zapis za clyA gen so pripravili z oznako Myc in ligirali v plazmid p15AOXBR, dobljeni plazmid pa poimenovali p15AOXBC. Zapisa za Rluc8 in ClyA sta bila pod obrnjenim promotorjem. Eden izmed plazmidov, ki nosi zapis za FimE (pJHFimTag ali pJHFimNoTag) in plazmid p15AOXBR so kotransformirali v bakterije CNC018. Kot kontrolo na Doxy – inducibilno stikalo so pripravili CNC018 bakterije, transformirane s pJH18-Rluc8(AP), pJH18-Rluc(RP) ali pJH19-ClyA(AP). V teh konstruktih je bil Rluc8 gen pod nadzorom promotorjev PtetA in Ptet, clyA gen pa pod promotorjem Ptet. Transformirane celice so preko noči gojili na 37 °C, jih razredčili v svežem LB mediju in nato gojili do srednje log faze, kjer so dodali različne koncentracije doksiciklina (0-500 ng/mL). Za preučevanje distribucije bakterij uporabili miške, ki so jim injicirali CT26 celice. Aplikacija je bila subkutana na desni bok. Ko je tumor dosegel velikost 80-120 mm3 so intravenozno injicirali CNC018 ali ΔppGpp bakterije. Ko je tumor dosegel 150 mm3 so intravenozno injicirali CNC018::pFimTagOXBR ali CNC018::pJH18-Rluc8(AP) bakterije. Prejele so oralno administracijo doksiciklina (1,7 mg/kg telesne teže) 1, 2 ali 3 dni po injiciranju z bakterijami. Za ugotavljanje proti tumorske aktivnosti Doxy – inducibilnega clyA stikala so uporabili CT26 in MC38 tumorske celice, ki so jih subkutano implementirali v ženske miške stare 6 tednov. Kot kontrolo si CNC018::pJH18-ClyA intravenozno injicirali v miške z mutacijo CT26.

Rezultati

Doxy - inducibilno stikalo je bilo sestavljeno iz dveh plazmidov. pJHFimTag, ki nosi ColE1 ori in odpornost na ampicillin. Kodira za represor TetR pod nadzorom šibkega konstitutivnega promotorja POXB1 in FimE z oznako Flag pod promotorjem PtetA. Za inverzijo je zadostna že nizka količina FimE, zato so odstranili RBS pred ORF. Drugi plazmid, ki je imel tarčo za rekombinacijo (p15AOXBR z Rluc8 ali p15AOXBR z clyA) je prisoten v nizkem številu kopij, nosi p15A ori, odpornost na kloramfenikol in OXB20 stikalni blok, ki ima močan konstitutivni promotor POXB20 s tarčnimi zaporedji za rekombinazo na obeh koncih. Preiskovana gena (GOI) sta bila na nasprotni strani POXB20. Ekspresijo so inducirali z dodatkom doksiciklina. Ob odsotnosti le-tega se je konstitutivno izražal TetR, kar je inhibiralo ekspresijo fimE gena. Ob prisotnosti le tega pa se doksiciklin veže na TetR in se sprosti s Ptet, kar inducira izražanje fimE, to pa inducira rekombinacijo OXB20 stikalnega bloka z POXB20 tako, da se usmeri proti GOI.

Funkcionalnost genetskega stikalo so ocenili z merjenjem bioluminescence, ki jo je generiral Rluc8. Bioluminiscenca se je povečala v odvisnosti od dodanega doksiciklina v prvih 18 urah nato pa se malo zmanjšala. Signal je bil precej višji v kolonijah, ki so bile transformirane s pGimTagOXBR v primerjavi s pFimNoTagOXBR, kar so pripisali temu, da se fimE gen z oznako bolje izraža. Da so izmerili v kolikšni meri je potekla rekombinacija so izvedli analizo z PCR. Uporabili so specifične primerje, ki bi morali delovati samo v primeru, ko je potekla rekombinacija (ON stanje). Pričakovanih fragmentov niso zaznali v bakteriji, kjer je bila koncentracija dodanega doksiciklina manj kot 5 ng/mL, kar pomeni da je bilo puščanje promotorja zanemarljivo majhno. Signifikantna meja detekcije je bila pri 20 ng/mL za CNC::pFimTagOXBR in 100 ng/mL pri CNC:pFimNoTagOXBR. Rezultati prenosa Western so bili konsistenti s tistimi dobljenimi pri bioluminiscenci in PCR.

Genetska stabilnost rekombinacije

FimE inducira enosmerno inverzijo gena, ki ima na robu inverzne ponovitve, rekombinaza namreč prepozna IRR bolj učinkovito kot IRL. Rekombinacija gena se zato ohranja in je dedna. Prenos Doxy – inducibilnega stikala so preverili z uporabo CNC018:pFimTaxOXBR bakterij, ki so jih inducirali z različnimi koncentracijah doksiciklina, jih gojili v prisotnosti le-tega 18 ur nato pa 3 dni gojili brez prisotnosti doksiciklina. Ekspresijo Rluc8 so ocenili s prenosom Western. Šibka lisa se je pojavila pri bakterijah, ki so prvotno rastle z doksiciklinom s koncentracijo 100 ng/mL in je naraščala s koncentracijo do 500 ng/mL. Pri koncentracijah pod 300 ng/mL je bila raven ekspresije Rluc8 po 18 urah inkubacije z doksiciklinom višja kot v kulturah odvzetih po treh dneh, kar so pripisali nepopolni rekombinaciji pri nižjih koncentracijah doksiciklina. Pri koncentraciji 500 ng/mL pa je bila rekombinacija stabilno ohranjena vsaj 3 dni.

Biodistribucija CNC018 bakterij v CT26 miškah

Prisotnost bakterij CNC018 in ΔppGpp so preverjali v tumorju, jetrih, vranici in krvi s kvantificiranjem viabilnih bakterijskih populacij 1, 2, 3 in 5 dni po administraciji. Oba seva sta pokazala močno prisotnost znotraj tumorja od prvega dne. Signifikantni delež ΔppGpp je bil zaznan v jetrih in vranici 1 in 2 dan, CNC018 pa niso bile prisotne v teh tkivih nad mejo detekcije (1x103 CFU). 1 dan po injiciranju v krvi niso zaznali niti CNC018, niti ΔppGpp. Prav tako so pokazali, da se lahko Doxy – inducibilni sistem v sevu CNC018 inducira že prvi dan aplikacije. Za tarčenje tumorja transformiranih bakterijskih celic so CNC018:pFimTagOXBR intravenozno injicirali v CT26 miške. Bioluminiscence niso zaznali 3 dni v miškah, ki niso dobile doksiciklina. Miši, ki so dobile doksiciklin 1, 2 ali 3 dni po administraciji so imele merljiv signal znotraj tumorja in so dosegle maksimum 2-3 dni po indukciji z doksiciklinom. Maksimalni signal je bil višji pri miših, ki so dobile doksiciklin 1 ali 2 dan. Glede na kontrolo so zaključili, da se bakterije z Doxy – inducibilnim stikalom lokalizirajo v tumorsko tkivo znotraj dveh dni po intravenozni aplikaciji in da je indukcija z doksiciklinom 1 ali 2 dni po injekciji optimalna za rekombinacijo.

Proti tumorski učinek transformiranih bakterij

In vivo protitumorski efekt CNC::pFimTagOXBC so okarakterizirali z uporabo konstrukta, ki je nosil pJHFimTag za izražanje FimE in p15AOXBC za izražanje ClyA. ClyA niso zaznali v odsotnosti doksiciklina, nizke koncentracije proteina pa so zaznali pri koncentraciji 5 ng/mL doksiciklina. Hemolitično aktivnost bakterije so ocenili z gojenjem na krvnem agarju v prisotnosti različnih koncentracij doksiciklina. Kolonije s hemolitičnimi conami so se pojavili na ploščah s koncentracijo 5 ng/mL, število pa je naraščalo z naraščajočo koncentracijo. ClyA se torej funkcionalno izraža po rekombinaciji. Protitumorski efekt so ocenjevali v BALB/c miškah z CT26 tumorji. Doksiciklin so oralno administrirali 1, 2 ali 3 dni po injiciranju bakterij. Miši, ki so tretirali z bakterijami v odsotnosti doksiciklina (brez indukcije) so imele signifikantno supresijo tumorja v primerjavi z netretiranimi mišmi. Supresivni efekt pa se je povečal v vseh skupinah, kjer je potekla indukcija, najopaznejša pa je bila v prvi skupini (indukcija 1 dan po aplikaciji bakterij). 51 dan so opazili popolno uničenje tumorja v skupinah, ki so bile inducirane z doksiciklinom (83%, 75% in 58% v vsaki skupini). Podobne protitumorske efekte so opazili tudi pri miših s tumorji MC38.

Zaključek

Sistem je omogočal nadzor nad ekspresijo tarčnega gena po enkratni administraciji doksiciklina. Učinkovitost je bila ocenjena in vitro in in vivo, kjer so potrdili, da je uspešen pri supresiji rasti tumorja v miših.

Literatura

[1] H. T.-T. Ngo, D.-H. Nguyen, S.-H. You, K. Van Nguyen, S.-Y. Kim, Y. Hong, J.-J. Min: Reprogramming a Doxycycline-Inducible Gene Switch System for Bacteria-Mediated Cancer Therapy. Mol Imaging Biol 2024, 26, 148–161.

[2] J. A. N. Brophy, C. A. Voigt: Principles of genetic circuit design. Nat Methods 2014, 11, 508–520.

[3] T. Taniura, Y. Iida, H. Kotani, K. Ishitobi, Y. Tajima, M. Harada: Immunogenic chemotherapy in two mouse colon cancer models. Cancer Science 2020, 111, 3527–3539.

Retrieved from "https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Optogenetsko_prostorsko_vzorčenje_kooperacije_pri_glivah_kvasovkah&oldid=23738"