PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

PETal je iGEM projekt ekipe IISER-TVM iz Indije iz leta 2024.

UVOD

Indijsko olje sandalovine je ena izmed najbolj iskanih surovin v kozmetični industriji. PETal ponuja inovativno rešitev za njegovo proizvodnjo, ki združuje reciklažno plastičnih odpadkov in proizvodnjo tega dišavnega olja s pomočjo sintezne biologije. Z uporabo gensko spremenjene bakterije Pseudomonas putida, ki lahko presnavlja monomere polietilen tereftalata (PET), torej tereftalno kislino (TPA) in etilen glikol (EG), so želeli sintetizirati santalen in santalol, ki sta glavni sestavini olja sandalovine.

Olje sandalovine

Sandalovina je vrsta lesa iz dreves iz rodu Santalum. Les ima značilen vonj, ki ga, za razliko od drugih aromatičnih lesov, lahko ohrani več desetletij. Iz tega lesa pridobivajo tudi olje sandalovine, ki s svojim vonjem dopolnjuje mnoge dišave, mila in kozmetiko po vsem svetu. Najbolj cenjena vrsta, Santalum album (indijska sandalovina), raste izključno na polotoku Indije in velja za eno izmed najdragocenejših vrst lesa na svetu. Molekulska struktura komponent olja sandalovine je edinstvena med lesenimi notami v parfumeriji. Seskviterpena α-santalol in β-santalol sta glavna nosilca vonja, ki ju pridobivajo iz sredice drevesa s parno destilacijo. Pridobivanje olja sandalovine pa je zelo dolgotrajen in drag proces. Drevesa za svojo rast potrebujejo 15-20 let, za 600 mL olja pa je potrebnih kar 20 kg lesa. Povpraševanje po sandalovini in olju sandalovine iz leta v leto narašča, ponudba pa je, glede na potrebe trga, premajhna.

PET plastika

Polietilen tereftalat (PET) je tretji najbolj razširjen polimer v embalažni industriji in prevladuje na trgu plastenk za pijače. Hkrati je tudi najpogostejša oblika plastičnih odpadkov v okolju. Čeprav ga je mogoče reciklirati mehansko ali kemijsko, pa so ti postopki predragi, da bi z njimi ponovno pridobivali osnovne surovine, zato se reciklira manj kot 30 % letne proizvodnje. V zadnjem času se kot obetavna alternativa uveljavlja biološka nadpredelava (angl. upcycling), ki bi lahko rešila ekonomske izzive klasičnih metod reciklaže PET.

Izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike

Da bi učinkovito naslovili pomanjkanje olja sandalovine in hkrati vzpostavili trajnostno zanko z uporabo PET odpadkov, je skupina iz Indije zasnovala modularni sistem PETal, ki omogoča krožno rabo surovin in valorizacijo plastičnih odpadkov. Polietilen tereftalat (PET) je sestavljen iz monomerov tereftalne kisline (TPA) in etilenglikola (EG). V okviru sintezne biologije so razvili modul, kjer mikroorganizmi proizvajajo komponente eteričnega olja sandalovine s pomočjo omenjenih monomerov. Z uporabo že prilagojenega seva bakterije Pseudomonas putida, ki lahko presnavlja TPA in EG, so prvič v ta organizem vnesli biosintetsko pot za proizvodnjo santalola, s čimer so iz PET odpadkov želeli proizvajati santalen in santalol.

Izvedba projekta

Izbira organizma in reševanje težav pri gojenju s pristopom ALE

Za organizem je skupina izbrala bakterijo Pseudomonas putida KT2440, zaradi njenega prilagodljivega metabolizma, robustnosti in sposobnosti rasti na različnih substratih. Šlo je za sev TA7-EG, ki je bil genetsko prilagojen za presnavljanje prej omenjenih monomerov TPA in EG pri 'nevtralnem pH. Skupina je imela na začetku nekaj težav pri gojenju seva 'P. putida TA7-EG na monomerih PET, saj so bakterije znatno rast dosegle šele po 24-36 urah. Reševanja težave so se lotili s pristopom adaptivne evolucije. Začeli so z medijem, ki je poleg TPA in EG vseboval še 5 % glukoze, nato pa so njen delež postopoma zniževali, dokler ni v mediju ostala le še kombinacija TPA in EG oz. posamezen monomer. Namen tega je bil postopoma privaditi sev na rast zgolj na monomerih PET. Po tem postopku so opazovali rast prilagojenega seva v različnih medijih (TPA, EG in TPA+EG) z merjenjem optične gostote (OD). Rezultati so pokazali, da je prilagojeni sev prešel v logaritemsko fazo hitreje kot izvorni TA7-EG, ki je za to potreboval več kot 2 dneva. Najhitrejša rast je bila opažena v mediju s kombinacijo TPA in EG, medtem ko je bil EG sam po sebi manj učinkovit.

Inženiring presnovne poti

Njihova strategija je vključevala preusmeritev toka ogljika iz monomerov PET proti naravni metabolni poti MEP za sintezo terpenoidov ter vnos biosintetske poti za santalol. Ta vključuje izražanje treh ključnih encimov iz Santalum album:

• farnezil pirofosfat sintaza (FPPS),
• santalen sintaza (SaSSy),
• citokrom P450 monooksigenaza (CYP736A167) s svojim reduktaznim partnerjem (CPR1).

Vsi sestavljeni encimski deli so bili zasnovani modularno, z uporabo zamenljivih promotorjev in mest za vezavo ribosomov, kar bi omogočalo prihodnjim ekipam in raziskovalcem nadaljnje testiranje. Tak pristop omogoča natančno uravnavanje izražanja ter preizkušanje vpliva različnih regulatornih elementov.