Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi: Difference between revisions
| Line 11: | Line 11: | ||
Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah: | Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah: | ||
* E. coli: medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100, | * ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100, | ||
* B. subtilis: 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43, | * ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43, | ||
* C. glutamicum: približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc, | * ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc, | ||
* P. pastoris: aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti, | * ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti, | ||
* S. cerevisiae: medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1. | * ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1. | ||
Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v P. pastoris so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2]. | Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v P. pastoris so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2]. | ||
Revision as of 17:24, 13 April 2025
Izhodiščni članek: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths
Uvod
Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov
Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov
Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
- E. coli: medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
- B. subtilis: 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
- C. glutamicum: približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
- P. pastoris: aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti,
- S. cerevisiae: medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1.
Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v P. pastoris so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].
