Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

Izhodiščni članek: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths

Uvod

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (angl. broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (E. coli JM109, B. subtilis 168, C. glutamicum ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (S. cerevisiae CEN.PK2-1C, P. pastoris GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za E. coli in B. subtilis, BHI za C. glutamicum ter YPD za S. cerevisiae in P. pastoris [2].

Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz E. coli, in sicer genov rrnD, rybB in rpoE, UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:

• E. coli: medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
• B. subtilis: 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
• C. glutamicum: približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
• P. pastoris: aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti,
• S. cerevisiae: medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1.

Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v P. pastoris so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

Zaključek

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

Literatura

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. 2021, 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth Syst Biotechnol 2025, 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. 2017.