Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov

Izhodiščni članek: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41612076/

Uvod

Z višanjem temperature okolja in odlaganjem hranilnih snovi v morske vode, se v zadnjih desetletjih zlasti ribiški in turistični sektor soočata s težavo nekontroliranega cvetenja alg. Velik izziv predstavlja hitra rast makroalg iz rodu Ulva, ki zaradi izpostavljenosti tokovom izgubijo stik s podlago in se začnejo nabirati na obalah. Makroalge Ulva so obdane s celično steno, katere glavni gradnik je polisaharid ulvan, ki predstavlja kar 30% suhe mase organizma [1, 2].

Ulvan je polisaharid kompleksne sestave, ki se med posameznimi vrstami rodu Ulva zelo razlikuje. V glavnem je zgrajen iz monosaharida L-ramnoze 3-sulfata (Rha3S, 49% molskega deleža), ki se poveže z D-glukuronsko kislino (GlcA, 23,8% molskega deleža) preko β-1,4 vezi. Namesto D-glukuronske kisline je lahko na L-ramnozo 3-sulfat vezana tudi L-iduronska kislina (IdoA) preko α-1,4 vezi ali ksiloza (Xyl) preko β-1,4 vezi. Glavna veriga se preko L-ramnoze 3-sulfata povezuje v kompleksno strukturo. Deleži različnih sladkorjev, ki so vezani na L-ramnozo se močno razlikujejo med posameznim vrstami v rodu Ulva [3].

Zaradi velikih količin alg, ki jih redno odstranjujejo iz obal je zato postal ulvan iz celične stene makroalg rodu Ulva pomemben vir monosaharidov. Veliki porabniki L-ramnoze na industrijski skali so tako živilska, kakor tudi farmacevtska, kozmetična in gradbeniška industrija [4, 5]. Razgradnja polisaharidov iz celilčne stene alg zato predstavlja veliko globalno prednost pred industrijsko sintezo L-ramnoze, saj odstranjevanje odpadne biomase iz morja ni več strošek, temveč vir dragocenih surovin.

Spremljanje razgradnje ulvana do končnega monosaharida L-ramnoze je postalo torej ključnega pomena za nadaljno industrijsko uporabo le-tega. Dosedanje tehnike so temeljile na kromatografskih metodah, preko katerih so kvantificirali razgradne produkte ob dodajanju ulvanolitičnih encimov polisaharidu. Tehnika analize je zaznavala spreminjanje koncentracije redukcijskih koncev, ki nastanejo ob cepitvi glikozidne vezi v polisaharidu. Preko vezave reagentov na redukcijske konce je prišlo do spremembe barve, preko katere so lahko sledili razgradnji ulvana na manjše sladkorne enote. Uporabljene kromatografske metode niso specifične, saj ne nudijo informacije o velikosti in identiteti nastalih sladkornih enot [1].

Zasnova ideje biosenzorja

Za razgradnjo kompleksnega polisaharida ulvana, so nekateri morski mikroorganizmi razvili ulvanolitične encime, s katerimi lahko dobljene monosaharide uporabijo kot vir energije. Primer takega organizma je morska bakterija Formosa Agariphila, ki nosi zapis za te proteine v regijah PUL (»polisaharide utilisation loci«) v svojem genomu. Pri izboljšavi detekcije razgradnje ulvana so Wolf in sod. uporabili ulvanolitične encime iz F. Agariphila. Biosenzor, ki je detektiral prisotnost L-ramnoze v mešanici pa je temeljil na sistemu, ki ga uporabljajo bakterije Escherichia Coli pri regulaciji metabolizma ramnoze. Plazmid, ki so ga znanstveniki uporablili, je poleg zapisov za proteine, ki se odzivajo na prisotnost L-ramnoze v celici, vseboval izboljšano obliko zelenega fluorescentnega proteina, sfGFP (»superfolded green fluorescent protein«). Ta je ob prisotnosti proste L-ramnoze deloval kot reporterski gen [1].

Regulacija presnove ramnoze pri E. Coli

Pri E. Coli sta ključna aktivatorska proteina RhaR in RhaS. RhaR je protein, ki se konstitutivno izraža in ob prisotnosti L-ramnoze deluje kot transkripcijski faktor za prepisovanje zapisa za protein RhaS. Ob prisotnosti obeh transkripcijskih aktivatorjev, RhaR in RhaS, pride do vezave RNA polimeraze na promotor P_rhaBAD in posledično izražanja genov, ki so odgovorni za presnovo ramnoze v celici [6]. Študije so pokazale, da je, tudi ob prisotnosti samega proteina RhaS, vezava RNA polimeraze na promotor P_rhaBAD, uspešna [7].

Promotor P_rhaBAD, v nasprotju s promotorji, kot sta npr. P_lac ali P_araBAD, ki delujeta po načelu »vse ali nič«, deluje sorazmerno s koncentracijo ramnoze v celici. Ob višji koncentraciji ramnoze je torej izražanje genov, ki se nahajajo navzdol od tega promotorja, močnejše [1].

Zgradba in delovanje biosenzorja

Pri ustvarjanju biosenzorja za detekcijo razgradnje ulvana pri makroalgah, je bila ključnega pomena specifičnost zaznave in uporaba učinkovitega reporterskega sistema, ki bi omogočal detekcijo tudi pri nizkih koncentracijah. Zaradi tega je bila izbira sistema za regulacijo presnove ramnoze iz E. Coli najprimernejša, kjer izražanje reporterskega proteina sfGFP sorazmerno narašča z naraščajočo koncentracijo ramnoze v celici [1].

Konstrukti za razgradnjo ulvana

Wolf in sod. so za učinkovito razgradnjo ulvana uporabili encime, ki so zapisani v genomu bakterije F. Agariphila v regiji PUL-H. Zapise za encime so vstavili v plazmid pET28a, ki vsebuje gen za odpornost proti kanamicinu, T7 promotor, za njim laktonski operon in multiplo klonirno mesto. Plazmid vsebuje tudi zapis za represor LacI, ki se veže na P_lac, ko laktoze oz. njenih analogov ni v celici. Zapise za želene encime P10_PL40, P24_GH3, P31_GH39, P32_S1_8, P33_GH105 in P36_S1_25 so vnesli za laktonskim operonom. Vsi izraženi ulvanolitični encimi so vsebovali tudi N-končno 6xHis oznako.

• P10_PL40: Ulvan liaza katalizira cepitev glikozidne vezi med GlcA ali IdoA in Rha3S. Nastane nenasičena uronska kislina na nereducirajočem koncu.
• P24_GH3: Glikozid hidrolaza hidrolizira vez med Xyl in Rha3S. Nastane Xyl-Rha3S-intermediat.
• P31_GH39: Ksilozidaza katalizira cepitev med Xyl in Rha3S in sprosti Xyl-Rha3S disaharid.
• P32_S1_8: Sulfataza odstrani eno sulfatno skupino iz sulfatirane ksiloze Xyl2S. Encim je potreben, ko je v polisaharidu sulfatirana tudi ksiloza, saj jo pripravi za naknadno cepitev glikozidne vezi.
• P33_GH105: Nenasičena glukuronil hidrolaza sprosti Rha3S iz produkta, ki ga je ustvarila ulvan liaza.
• P36_S1_25: Sulfataza odstrani sulfatne skupine iz Rha3S in sprosti L-ramnozo.

Rekombinantne proteine so izražali v celicah E. Coli seva BL21(DE3), saj ta sev izraža RNA polimerazo T7, ki omogoča izražanje genov v multiplem klonirnem mestu na plazmidu pET28a. Selekcijo celic, ki so uspešno sprejele plazmid, so izvedli z dodatkom kanamicina v gojišče. Izražanje encimov so inducirali z dodajanjem IPTG. Lizate celic so nanesli na kolono za Ni²⁺ afinitetno kromatografijo in zbirali frakcije eluiranih encimov. Izolirani encimi so bili tako pripravljeni za razgradnjo ulvana [1].

Viri

1. Y. L. Wolf, T. Bayer, U. T. Bornscheuer: A genetically encoded L-rhamnose biosensor for monitoring marine polysaccharide depolymerization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2026, 110, 50. DOI: 10.1007/s00253-026-13724-1
2. L. Reisky, A. Préchoux, M.-K. Zühlke, M. Bäumgen, C. S. Robb, N. Gerlach, T. Roret, C. Stanetty, R. Larocque, G. Michel, idr.: A marine bacterial enzymatic cascade degrades the algal polysaccharide ulvan. Nat. Chem. Biol. 2019, 15, 803–812. DOI: 10.1038/s41589-019-0311-9
3. A. S. Jagtap, C. S. Manohar: Overview on Microbial Enzymatic Production of Algal Oligosaccharides for Nutraceutical Applications. Mar. Biotechnol. 2021, 23, 159–176. DOI: 10.1007/s10126-021-10027-6
4. K. Slámová, J. Kapešová, K. Valentová: “Sweet Flavonoids”: Glycosidase-Catalyzed Modifications. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2126. DOI: 10.3390/ijms19072126
5. V. Kaur, M. B. Bera, P. S. Panesar, H. Kumar, J. F. Kennedy: Welan gum: Microbial production, characterization, and applications. Int. J. Biol. Macromol. 2014, 65, 454–461. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2014.01.061
6. S. M. Egan, R. F. Schleif: A Regulatory Cascade in the Induction of rhaBAD. J. Mol. Biol. 1993, 234, 87–98. DOI: 10.1006/jmbi.1993.1565
7. J. R. Wickstrum, J. M. Skredenske, A. Kolin, D. J. Jin, J. Fang, S. M. Egan: Transcription Activation by the DNA-Binding Domain of the AraC Family Protein RhaS in the Absence of Its Effector-Binding Domain. J. Bacteriol. 2007, 189, 4984–4993. DOI: 10.1128/JB.00530-07