NomNomNylon

Projekt: Projekt skupine DTU Denmark

Uvod

Najlon je naziv za skupino sinteznih polimerov, ki spadajo v skupino poliamidov. Je termoplastičen material, ki ga gradijo monomeri povezani s peptidno vezjo. Široko se uporablja v tekstilni industriji, najbolj znamenit primer so ženske najlonske nogavice. Danes se na široko uporablja za proizvodnjo športnih oblačil, kopalk, puhovk in vetrovk. Vsako leto nastane 92 milijonov ton tekstilnega odpada, napoved za leto 2030 pa je kar 134 milijonov to. Vsako leto namreč nastane 100 milijard novih kosov oblačil. To predstavlja veliko ekološko in tudi ekonomsko breme, saj na letni ravni povzroča izgube v vrednosti 500 milijard ameriških dolarjev. Najlon je eden izmed najzahtevnejših za razgradnjo in reciklažo. Uspešno se ga reciklira samo 2%. V primerjavi z bombažem, ki je biorazgradljiv najlon in poliestreom, ki ga lahko mehansko recikliramo najlon ostaja desetletja preden in se fragmentira v mikroplastiko. Mehansko recikliranje pri najlonu ni uporabno zaradi njegove kompleksne kemične strukture, naprednejši proces kemičnega recikliranje pa je še v zgodnjih fazah razvoja in še ni široko uporabljena metoda. Reševanja problema se je lotila študentska ekipa DTU Denmark na tekmovanju iGEM leta 2025.

O projektu

Ekipa je projekt naredila na podlagi DBTL koncepta kar pomeni Design Build Test Learn oz. v prevodu Načrtuj-Zgradi-Testiraj-Nauči se. Ta združuje računalniško načrtovanje in eksperimentalno delo v laboratoriju. Zasnova projekta je naslednja. Vse se začne s kupom odpadnega najlona, ki predstavlja vir ogljika. Da bi te odpadke predelali, moramo najlon najprej razgraditi na njegove osnovne gradnike.To dosežemo z brezcelično encimsko predobdelavo. Pri tem uporabljamo izboljšano različico encima najlonaze NylC, ki smo jo optimizirali s pomočjo računalniškega načrtovanja proteinov.NylC ima namreč v osnovi nizko aktivnost in ni termostabilen, kar omejuje učinkovitost razgradnje najlona. Tako pripravljene oligomere in monomere nato prevzamejo gensko spremenjene bakterije Pseudomonas putida. Ta vrsta bakterij ima zelo raznolik metabolizem, kar je idealno za uporabo v sintetični biologiji. Spremenjena je tako, da lahko poleg monomerov razgradi tudi oligomere, kar ji omogoča sintetičen nylABC operon inkorporiran v njen genom. Končni produkt z visoko dodano vrednostjo je indigoidin. Gre za biološko pridobljeno nestrupeno barvilo, ki bi nadomestilo sicer petrokemijsko pridobljen indigo. Oba se uporabljata v postopku barvanja kavbojk.

Računalniško načrtovanje

Najlonaze so encimi sposobni razgradnje najlona. NylC začne depolimerizacijo nylon-6, ki je poglaviten v tekstilni industriji. NylC cepi 6-aminohexanoate(Ahx) polimere v oligomere. Deluje poljubno v sredini, kar je ključnega pomena. NylC je N-terminalna nukleofilna (Ntn) hidrolaza. Po procesu samocepitve preide iz nekativno v aktivno obliko encima. Druga hidrolaza je še NylB, ki je aktivna na koncih verig in cepi linearne oligomere v krajše verig. Sledi še NylA, ki specifično prepoznava ciklične dimere in pretvarja cikličen Ahx2 v linearno obliko. NylA, NylB in NylC skupaj tvorijo kooperativen mehanizem,ki nas pripelje do željenega končnega monomera Ahx - 6 - amoniheksanoat. Bakterijski sevi s kateri so delali v nadaljevanju so vsebovali vse tri najlonaze, saj so bili podvrženi procesu ALE - adaptivna laboratorijska evolucija, in so sposobni rasti na različnih monomerih najlona vključno z Ahx.

Omejuje nas dejstvo, da je za proces razgradnje najlona potreben korak predobdelave. Uporablja se NylC, ki pa ima nizko učinkovitost in ni termostabilen. NylC ne zadostuje za tovrstno predobdelavo, saj je pretvorba izvedljiva le nad temperaturo steklastega prehoda najlona, ki je pri približno 55 °C, medtem ko ima encim NylC temperaturo taljenja Tm pri 52 °C. Da bi premagali to oviro, je ekipa zasnovala in razvila postopek za inženirstvo proteinov. Ta uporablja najsodobnejša orodja, temelječa na strojnem učenju, kot sta ThermoMPNN in ESM, ter njihov lastni proteinski jezikovni model Axolotl. Axolotl je difuzijski proteinski jezikovni model zmožen generiranje proteinskih sekvenc de novo. ThermoCraft je visoko zmogljiv in od vrste proteina neodvisen postopek za načrtovanje mutacij za izboljšano termostabilnost in aktivnost. Postopek deluje v načinu za posamezne točkovne mutacije, z uporabo orodja ThermoMPNN in v načinu za hkratno uvajanje številnih sprememb z uporabo modela Axolotl in Pottsovega modela.

Raziskali so tudi encimsko biodiverziteto s pomočjo rudarjenja sekvenc (sequence mining). Temeljilo je na odkritju TvgC, termofilne različice encima NylC. Ta je izjemno termostabilna, Tm= 93°C in je aktivna na najlon-6 in najlon-66 različicah. Ostane termostabilna tudi po enem tednu izpostavljenosti na 60°C. Sistematično so iskali neraziskane termostabilne najlonaze v termostabilnih organizmih. Naredili so podatkovno bazo proteinov iz termofilov na podlagi podatkovnih baz ThermoBase in UniProt. Pridobljene proteinske sekvence so bile analizirane s pomočjo Foldseek in JackHMMER. Foldseek temelji na strukturnih homologijah, medtem ko JackHMMER na sekvenčnih homologijah. Te analize so obrodile več potencialnih homologov, ki so jih omejili s filtriranjem glede na prisotnost in poravnavo katalitičnih ostankov encima NylC - Lys189, Asn219, Thr267, Asp306 and Asp308. Še višjo raven filtriranja so dosegli z uporabo mrež podobnosti zaporedij (SSN) pri pragu poravnave 100, kar je omogočilo identifikacijo skupine homologov, ki so tesno povezani s TvgC. Na žalost teh homologov zaradi pomanjkanja časa niso uspeli eksperimentalno potrditi in karakterizirati.

Viri

1.) https://2025.igem.wiki/dtu-denmark/ 2.) https://sl.wikipedia.org/wiki/Najlon