Medvrstni prenos kromosomov v kvasovkah vodi do izboljšanja fenotipa in raznolikih transkripcijskih odzivov

Izhodiščni članek: Intergeneric chromosomal transfer in yeast results in improved phenotypes and widespread transcriptional responses

Uvod

Prenos genov med organizmi je eden glavnih načinov za njihovo prilagoditev. Preko prenosa kromosoma je ta proces zelo intenziven, zaradi velikega števila genov, ki jih ta ima. Eden izmed načinov prenosa je s hibridizacijo [1]. V preteklosti smo se ljudje že poslužili takih prenosov, saj nam omogočajo pridobivanje novih, za industrijo pomembnih sevov. Najbolj znan primer je verjetno Saccharomyces pastorianus, ki je sev za pridobivanje lager piva. Raziskovanje prenosa genov med organizmi pa nam da tudi vpogled v evolucijo genov ter njihovih regulatornih elementov [2, 3]. V raziskavi so preučevali posledice in mehanizme prenosa kromosoma Saccharomyces cerevisiae (naprej Sc) v njej daljno sorodno Kluyveromyces marxianus (naprej Km). Ta vrsta kvasovke je bila že v preteklosti predlagana kot modelni organizem za bioprodukcijo heterolognih proteinov ter bioetanola. Ima namreč nekatere lastnosti, ki so v industriji zelo koristne, kot npr. hitra rast, termo toleranca ter asimilacija raznih sladkorjev. Do sedaj pa so prenose kromosomov opravljali med sorodnimi vrstami. Sc in Km pa sta se ločili kar 114 milijonov let nazaj. V predhodnih raziskavah so prenos že poskušali opraviti s fuzijo protoplastov Sc in Km, a se je izkazalo, da Sc kromosom ni stabilen po njej. Vzrok so pripisali nekompatibilnosti elementov podvojevanja (CEN in ARS).

Priprava krožnih kromosomov

Za prenos kromosoma iz Sc v Km so raziskovalci najprej morali zagotoviti možnost pravilnega podvojevanja. Vrsti se namreč precej razlikujeta po številu ARS regij in dolžini CEN regije. Na vektor so zato vstavili različne kombinacije ARS in CDE, ga transformirali v Km, opazovali uspešnost transformacije in ohranjanje plazmida v celici. Uspešne kombinacije pa ni bilo mogoče zamenjati z nobenim zaporedjem iz Sc. Da bi obšli oviro so razvili ti. »dvojni CEN/ARS plazmid«. Imel je ARS in CEN regije obeh vrst kvasovk in se ohranjal v obeh. Problem nekompatibilnosti so rešili tako, da so dodali Km ARS in CEN regije v kromosom Sc. Ob uporabi dvojnih plazmidov so želeli izvesti križanje ter pridobiti diploide. Križanje ni bilo uspešno, zato so se odločili, da je nujen umeten način pridobivanja hibridov, ki so jih poimenovali KS.

Prenos kromosomov v drugo vrsto

Za prenos so izbrali kromosom 1 in 3 kvasovke Sc. Najprej so odstranili telomere, da bi preprečili nekompatibilnost in nato kromosome zaokrožili. V naslednjem koraku so dodali regiji Km CEN/ARS na krožna kromosoma v bližino originalne regije ScCEN. Nastala kromosoma so poimenovali R1 in R3. Krožna kromosoma nista vplivala na obnašanje Sc v fizioloških pogojih. Kromosoma so nato ločeno transformirali v Km s postopkom protoplastne transformacije. Transformante so poimenovali KS-R1 in KS-R3. Po transformaciji so opravili diagnostični PCR in sekvenciranje, da bi potrdili odsotnost večjih mutacij. Naredili so rastne krivulje transformant v YPD, ki so si bile zelo podobne. Kot kontrolo so imeli sev Km s praznim dvojnim vektorjem (naprej KmV). Brez selekcijskega pritiska sta bila kromosoma zelo stabilna. Transformante so bile robustne tudi pod bolj ostrimi pogoji, kot je npr. visoka slanost.

Spremembe fenotipa ob prisotnosti kromosomov

KS seve in njihove starše so izpostavili 28 drugačnim dejavnikom, ki so predstavljali pogoste stresorje za kvasovke. Primerjali so KS seva s ScV in KmV. Za kontrole so imeli tudi Sc-R1 in Sc-R3, da bi opazili možne spremembe zaradi krožnih kromosomov, ampak so njihovi rezultati bili enaki rezultatom ScV. Za vsak Sc sev so semi- kvantificirali rast na trdem YPD gojišču pri 30° C ter primerjali s Km, da bi določili medvrstno razliko. Ta se je pokazala v 17- ih od 28-ih dejavnikih. Oba seva KS sta bila v večini okoljih bolj podobna Km, torej dodatek enega kromosoma ni veliko vplival na metabolično reprogramiranje Km. Pod nekaj pogoji pa sta bila KS seva občutno različna. Ti novi fenotipi so bili specifični glede na R1 oz. R3, torej niso bili zgolj posledica kromosomov. Potrdili so tudi, da fenotipi niso posledica mutacij v gostujočem Km, saj se je fenotip izgubil ob izgubi kromosoma.

SPS22

Dodatek kromosomov je privedel k nastanku nekaterih fenotipov, ki so bili superiorni fenotipom staršev v stresnih pogojih. KS-R3 je bil bolj toleranten za NaCl, ki je pogost stresor v industriji. Kot glavni gen za višjo toleranco so določili gen ScSPS22. Ta gen sodeluje pri beta-glukan sintezi, ki vpliva na celično steno. Nenavadno pa je, da ta gen ob veliki ekspresiji v Sc zmanjša njeno toleranco za slanost. Da bi razumeli vpliv cis regulatornih regij na fenotip zaradi ScSPS22, so konstruirali himerni alel, ki je bil sestavljen iz promotorja Km (FIMI_814) ter CDS gena ScSPS22, ter alel poimenovali PKm-ScSPS22. Celoten gen ScSPS22 so na centromernem plazmidu transformirali tudi v Km. Poleg tega so analizirali še KmSPS22 iz genoma Km, tudi na centromernem plazmidu. Vse naštete seve so opazovali na trdnem gojišči YPD+ NaCl. Rezultati so pokazali, da je sev s himernim alelom imel nižjo toleranco, kot pa gen ScSPS22 z originalnim promotorjem na vektorju v Km. Ključna je torej razlika med promotorskimi regijami Sc in Km. Po analizi so našli večjo količino mRNA ScSPS22 v sevu KS-R3, kot pa v Sc-R3 s qPCR ob prisotnosti NaCl in brez. Med sevoma je seveda velika razlika v trans regulatorjih. Poleg tega je bilo izražanje gena v KS-R3 konstantno, ne glede na prisotnost NaCl v gojišču. V kontroli Km s centromernim plazmidom, so dokazali enake količine mRNA, kot v KS-R3. Himerni alel je imel torej v Km nižje izražanje zaradi cis- regulatorne regije PKm.

FLO9

Za seve KS-R1 so odkrili večjo nagnjenost k flokulaciji, v primerjavi s Sc-R1 in KmV. Fenotip se izgubi, ko odstranimo R1 iz KS. Gen, ki je ključen za to lastnost je gen ScFLO9 na R1. V Km so transformirali ScFLO9 gen in njegovo cis- regulatorno regijo s centromernim plazmidom in našli enako količino sedimentacije kakor v KS-R1. Enako so ta gen ter cis- regulatorno regijo transofrmirali v Sc na 2μ plazmidu z veliko kopijami, a je bila ta mera sedimentacije še vedno del ozadja. Tudi tukaj so analizirali količine mRNA s qPCR v različnih sevih. Našli so večje količine mRNA v KS-R1, enaka količina je bila tudi v Km s centromernim plazmidom s to regijo. Kvasovka Km pa ima tudi ortolog gena ScFLO9 in sicer je to gen KmFLO5. Ekspresija tega gena v KS pa ni bila povečana. Ugotovili so, da ni velike razlike v regulaciji genov genoma Km v KS glede na KmV. Gen ScFLO9 z regulatorno regijo so, na centromernem plazmidu in 2μ plazmidu, transformirali v Sc. V obeh primerih niso opazili sedimentacije, ki bi odstopala od ozadje. S primerjavo vseh sevov za oba gena so raziskovalci prišli do sklepa, da je v obeh primerih za spremembo fenotipa ključna kombinacija cis- regulatornih regij Sc genov ter trans- faktorjev Km.

Transkripcijski odgovor na prisotnost krožnih kromosomov

Za transkriptomsko analizo so pripravili kulture straševskih sevov Km ter KS seve v gojičjih YPD, YPD+ 1 M NaCl ter YPD+ 1 ug/mL tunikamicin (TM). Našli so aktivno transkripcijo genov iz R1 in R3 v vseh treh gojiščih. Korelacija med izraženimi geni v KS, Sc-R1 in Sc-R3 sevih je bila zelo nizka, vzrok pa je vpliv trans regulatorjev Km. V sevu KS-R3 so določili regijo na kromosomu R3, ki je imela najbolj intenzivno izražanje. To je bilo območje okrog regije HML. Ta lokus je v Sc namreč represiran s SIR kompleksom. V primeru Sc-R3, je bila torej količina mRNA teh genov majhna. Lokus pa se močno prepisuje v KS, kjer njegov represor nima vseh potrebnih proteinov za uspešno represijo. Dokazali so tudi, da R1 in R3 vplivata na izražanje genov iz kromosoma Km. Na obeh krožnih kromosomih so namreč zapisi za transkripcijske faktorje (TF). Opazili so drugačno izražanje ortolognih genov Sc, ki jih uravnavajo ti TF, iz kromosoma Km. Količina genov na kromosomu, ki imajo drugačno regulacijo, se v stresnih pogojih zmanjša. Torej je regulacija Km genoma dominantna ob prisotnosti stresorjev. Takrat ne vidimo vpliva Sc kromosomov na genom Km.

Koevolucija cis in trans regulatornih faktorjev

Da bi karakterizirali regulatorno razliko med Sc in Km, so identificirali ortologne gene med sevoma. Našli so, da ima 106 genov od 162 ortologov veliko razliko v ekspresiji. Glede na gene Sc so jih razdelili na: Sc podobne, Km podobne in transgresivne. Preneseni geni so večinoma imeli transgresivno izražanje, sem spadata tudi gena SPS22 in FLO9. Tako izražanje genov je verjetno vzrok za razvoj novih fenotipov[4]. Opravili so PCA (principal component analysis) prenesenih genov, ki je ponovno pokazala, da prevladujejo geni, ki imajo transgresivno izražanje. Za transgresivnim izražanjem so bili po pogostosti uvrščeni geni, ki imajo »Sc podobno« izražanje. To dokazuje, da so cis regije ključnega pomena za izražanje. V stresnih pogojih pa so prevladovali »Km podobni« regulirani geni, kar kaže na trans- evolucijo ob okoljskem pritisku. Veliko ortolognih genov, ki so jih določili na R1, R3 in genomu Km pa so imeli ohranjeno izražanje glede na izražanje pred transformacijo. To so bili predvsem hišni geni, kot so geni za sintezo ribosomov, rRNA procesiranjem.

Zaključek

Raziskovalci so v članku predstavili nov način umetnega prenosa kromosomov med nesorodnima vrstama. Pokazali so, da se izražanje večina genov spremeni zaradi drugačne interakcije med cis-regulatornimi regijami donorja in trans regulatorjev gostitelja. Nadaljni razvoj tega pristopa je morda ključen za pridobivanja novih industrijsko zanimivih fenotipov kvasovk.

Literatura

1. Soucy, Shannon M., Huang, Jinling and Gogarten, Johann Peter. Horizontal gene transfer: building the web of life. Nature Reviews Genetics. August 2015. Vol. 16, no. 8, p. 472–482. DOI 10.1038/nrg3962.

2. Signor, Sarah A. and Nuzhdin, Sergey V. The Evolution of Gene Expression in cis and trans. Trends in Genetics. July 2018. Vol. 34, no. 7, p. 532–544. DOI 10.1016/j.tig.2018.03.007.

3. Lyu, Yilin, Shi, Yi, Song, Kunfeng, Zhou, Jungang, Chen, Hao, Li, Xueying C., Yu, Yao and Lu, Hong. Intergeneric chromosomal transfer in yeast results in improved phenotypes and widespread transcriptional responses. Nature Communications. 8 January 2026. Vol. 17, no. 1, p. 1419. DOI 10.1038/s41467-025-68164-8.

4. Rieseberg, Loren H, Archer, Margaret A and Wayne, Robert K. Transgressive segregation, adaptation and speciation. Heredity. October 1999. Vol. 83, no. 4, p. 363–372. DOI 10.1038/sj.hdy.6886170.