TasAnchor

TasAnchor je iGEM projekt ekipe SCU-China s Kitajske iz leta 2025. Skupina je zasedla 1. mesto na področju bioremediacije.

Uvod

Gensko spremenjene bakterije imajo velik potencial za čiščenje industrijskih odpadnih voda, saj so sposobne zaznavati, adsorbirati in razgrajevati škodljive snovi v vodi, vključno s sintetičnimi barvili, težkimi kovinami, naftnimi ogljikovodiki, polikloriranimi bifenili (PCB), benzalkonijevim kloridom in agrokemikalijami.

PREHITRO IZPIRANJE BIOFILMA

Vendar pa je ena glavnih ovir, ki omejuje široko uporabo gensko spremenjenih bakterij, prehitro izpiranje biofilma, njegova slaba stabilnost in nizka celična gostota v praktičnih pogojih. V čistilnih napravah za odpadne vode visoka hidravlična obremenitev izpere mikroorganizme iz čistilnih reaktorjev hitreje, kot se lahko razmnožujejo. Aktivna mikrobna biomasa se tako odstrani iz reaktorja, še preden pride do zadostnega stika z onesnaževalcem, zato sta adsorpcija in razgradnja neuspešni. Biofilmski sistem za obdelavo odpadnih voda je biološki aeriran filter (BAF), ki deluje na osnovi prehoda vode skozi filtrirni medij, na površini katerega se razvije biofilm, ki iz vode odstranjuje škodljive snovi. Čiščenje poteka preko adsorpcije odpadnih snovi na površino biofilma in mehanske filtracije, ki omogoča zadrževanje delcev v strukturi medija. Filtrirni medij omogoča imobilizacijo mikroorganizmov, njihovo rast in kolonizacijo. Najpogosteje se v ta namen uporablja polistirenska pena. Ker je hidrofobna, na njej nastajajo manj gosti biofilmi, zato je tudi sistem čiščenja manj učinkovit. Te težave skuša odpraviti projekt TasAnchor. Z izbitjem gena tasA in sinR ter modifikacijo površinskega proteina TasA, so izboljšali njegovo adhezijo in sposobnost celic za tvorbo biofilma na polistirenu. Bakterijo Bacillus subtilis so imobilizirali na trdno površino.

ONESNAŽENJE S KADMIJEVIMI IONI

Kadmij je toksična in obstojna težka kovina, ki predstavlja resno okoljsko tveganje. Onesaženje s kadmijem je še posebej resno, ker je ta rakotvoren in zato nevaren za zdravje ljudi. Ima dolgo razpolovno dobo in se težko izloči iz telesa. Da bi preverili funkcionalnost konstrukta TasAnchor, so ga poskusili uporabiti pri detekciji onesnaženja s Cd2+ ter adsorpciji in desorpciji kovinskega iona.

SAMOUNIČEVALNI SISTEM

Da bi preprečili nenadzorovano preživetje ali širjenje sistema TasAnchor, uporabljenega pri filtraciji težkih kovin, so zasnovali samouničevalni preklopni sistem, ki omogoča, da Bacillus subtilis umre, ko zapusti trden nosilec. Samouničevalno stikalo, ki so ga pripravili, deluje na osnovi zaznavanja celične gostote.

Zasnova projekta in načrtovanje poskusov

IZBITJE GENOV sinR/tasA

Protein TasA je amiloidni protein, ki pri bakteriji Bacillus subtilis predstavlja glavno komponento zunajceličnega matriksa biofilma. Protein SinR pa deluje kot regulator tvorbe biofilma. V tetramerni obliki se veže na operator epsA-O in tapA-sipW-tasA, s čimer zavira sintezo komponent biofilmskega matriksa, kot so zunajcelični polisaharidi in protein TasA. Za modifikacijo biofilmskih proteinov pri gensko spremenjenih bakterijah in povečanje tvorbe biofilma so z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 in s homologno rekombinacijo iz genoma Bacillus subtilis 168 izbili gena tasA in sinR. V vektor pJOE8999 so z metodama z metodama kloniranja "Golden Gate" in homologne rekombinacije vstavili homologne roke in zaporedje usmerjevalne RNA, da so konstruirali CRISPR-Cas9 plazmid za izbijte genov.

IZBOLJŠANJE ADHEZIJE BAKTERIJ NA NOSILEC

Protein TasA, kot glavna strukturna komponenta biofilmov bakterije Bacillus subtilis, ima sposobnost samosestavljanja. Izločeni monomeri TasA tvorijo vlaknaste strukture v zunajceličnem matriksu, ki imajo adhezivne lastnosti. Načrtovali so izboljšavo proteina TasA z dvema pristopoma: z ustvarjanjem fuzijskih proteinov TasA in z uporabo sistema SpyTag/SpyCatcher. Z izboljšavami so želeli povečati njegovo adsorpcijo na polistiren kot filtrirni medij v biofiltrih ter s tem omogočiti imobilizacijo celic na trdnih nosilcih.

FUZIJSKI PROTEINI

Da bi povečali adhezijsko sposobnost bakterij so za pripravo fuzijskih proteinov s TasA izbrali adhezijski protein Mfp5, ki omogoča trdno pritrjanje školjk na podvodne površine. Poleg interakcij s površino, verige Mfp5 interagirajo tudi med samo in tvorijo stabilno in dobro adhezivno mrežo. Nato pa so za pripravo fuzijskih proteinov s TasA uporabili še peptide, ki imajo sposobnost specifične vezave na polistiren. Zasnovali so jih z uporabo metod "Evidence Deep Learning" (EDL) in "Biased Random-Key Genetic Algorithm" (BrKGA).

SISTEM SpyTag/SpyCatcher

Velike fuzije, kot je TasA–Mfp5, lahko negativno vplivajo na sekrecijo in sposobnost samosestavljanja proteina TasA, kar lahko vodi do zmanjšane adhezijske sposobnosti. Da bi odpravili to težavo, so za inženiring proteina TasA uporabili sistem SpyTag/SpyCatcher, ki omogoča učinkovito kovalentno povezovanje proteinov preko stabilnih izopeptidnih vezi med peptidom SpyTag in proteinom SpyCatcher. Molekulska masa njegovih komponent je majhna, kar zmanjšuje vpliv na sekrecijsko učinkovitost in samosestavljanje TasA ter s tem ohranja njegovo adhezijsko funkcijo. Kot vezavni element so uporabili protein Mfp5, z zamenjavo tega adhezijskega proteinskega dela pa bi lahko adhezijo prilagodili različnim filtrirnim materialom.

SANACIJA ONESNAŽENJA S KADMIJEM

Biosorpcija je pogosto uporabljena metoda za odstranjevanje težkih kovinskih ionov iz odpadnih voda. Za preverjanje učinkovitosti pritrjanja celic so izbrali sanacijo onesnaženja s Cd²⁺, toksično in obstojno težko kovino, ki predstavlja resno okoljsko tveganje.

DETEKCIJA KADMIJA

Za njegovo zaznavanje so zasnovali biosenzorski sistem na osnovi transkripcijskega faktorja CadR, ki specifično prepoznava in veže Cd²⁺ ter preko promotorja pCadR aktivira transkripcijo gena za mCherry. Gen cadR so modularno povezali z genom mCherry in s tem konstruirali orodje za specifično zaznavanje Cd²⁺ v odpadni vodi. Delovanje sistema so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence pri različnih koncentracijah Cd²⁺.

ADSORPCIJA KADMIJA

Za specifično in učinkovito adsorpcijo Cd²⁺so uporabili metalotionein SmtA iz cianobakterij. Zasnovali so fuzijski protein SmtA–TasA, ki omogoča obnovo tvorbe biofilma ter hkratno adsorpcijo in zajemanje Cd²⁺, s čimer se zmanjša njegova koncentracija v odpadni vodi. Kadmijevi ioni se adsorbirajo na SmtA preko njegovih funkcionalnih skupin. V kislem okolju pa H+ ioni tekmujejo za vezavo na funkcionalne skupine in izmenjajo težke kovinske ione. Adsorpcijsko učinkovitosti in potrdili toleranco seva na Cd²⁺ so preverili z analizo tvorbe biofilma in preostale koncentracijo Cd²⁺ v obdelani vodi pri različnih koncentracijah Cd²⁺.

ZAZNAVANJE CELIČNE GOSTOTE

Za preprečevanje nenadzorovanega preživetja ali širjenja sistema TasAnchor so na osnovi poti ComQXPA in sistema toksin–antitoksin mazEF zasnovali samouničevalni sistem zaznavanja celične gostote. Gensko spremenjene bakterije pritrjene na trden medij so v okolju z visoko celično gostoto. Signalni peptid ComX preko ComX poti aktivira promotor PsrfA, kar sproži izražanje proteina LacI. LacI zavira promotor Pgrac in s tem preprečuje izražanje toksina MazF, kar omogoča preživetje celic. Ko bakterije zapustijo nosilec, se gostota populacije zmanjša. Koncentracija ComX pade, PsrfA postane neaktiven, izražanje LacI se ustavi, MazF pa se sprosti, kar vodi do aktivacije toksina in celične smrti. Gen za antitoksin MazE, ki ga poganja promotor p43, pa zagotavlja začasno zaščito in zmanjšuje toksičnost zaradi morebitnega puščanja izražanja MazF pri visoki gostoti celic. Preverili so odzivnost promotorja PsrfA na celično gostoto, citotoksičnost proteina MazF ter zaščitni učinek MazE.

Viri

https://2025.igem.wiki/scu-china/

https://teams.igem.org/5810