TasAnchor: Difference between revisions

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search
← Older editNewer edit →
Jasna Čarman (talk | contribs)
37 edits
No edit summary
No edit summary
Line 3: Line 3:
== Uvod ==
== Uvod ==


Gensko spremenjene bakterije imajo velik potencial za čiščenje industrijskih odpadnih voda, saj so sposobne zaznavati, adsorbirati in razgrajevati škodljive snovi v vodi, vključno s sintetičnimi barvili, težkimi kovinami, naftnimi ogljikovodiki, polikloriranimi bifenili (PCB), benzalkonijevim kloridom in agrokemikalijami.  
Gensko spremenjene bakterije imajo velik potencial za čiščenje industrijskih odpadnih voda, saj lahko zaznavajo, adsorbirajo in razgrajujejo škodljive snovi v vodi, kot so sintetična barvila, težke kovine in agrokemikalije.


'''PREHITRO IZPIRANJE BIOFILMA'''
'''PREHITRO IZPIRANJE BIOFILMA'''


Vendar pa je ena glavnih ovir, ki omejuje široko uporabo gensko spremenjenih bakterij, prehitro izpiranje biofilma, njegova slaba stabilnost in nizka celična gostota v praktičnih pogojih. V čistilnih napravah za odpadne vode visoka hidravlična obremenitev izpere mikroorganizme iz čistilnih reaktorjev hitreje, kot se lahko razmnožujejo. Aktivna mikrobna biomasa se tako odstrani iz reaktorja, še preden pride do zadostnega stika z onesnaževalcem, zato sta adsorpcija in razgradnja neuspešni.
Ena glavnih ovir pri uporabi gensko spremenjenih bakterij je prehitro izpiranje biofilma, njegova slaba stabilnost in nizka celična gostota v praktičnih pogojih. Visoka hidravlična obremenitev v čistilnih napravah izpere mikroorganizme hitreje, kot se ti lahko razmnožujejo, kar zmanjša učinkovitost čiščenja. Biofilmi so ključni za proces čiščenja odpadnih voda, saj omogočajo adsorpcijo in mehansko filtracijo. Filtrirni medij, kot je polistirenska pena, omogoča imobilizacijo mikroorganizmov, vendar je zaradi hidrofobnosti pene nastal biofilm manj gost. Projekt TasAnchor rešuje ta problem z izboljšanjem adhezije in sposobnosti celic za tvorbo biofilma na polistirenu z izbitjem genov ''tasA'' in ''sinR'' ter modifikacijo površinskega proteina TasA v bakteriji ''Bacillus subtilis''.
Biofilmski sistem za obdelavo odpadnih voda je biološki aeriran filter (BAF), ki deluje na osnovi prehoda vode skozi filtrirni medij, na površini katerega se razvije biofilm, ki iz vode odstranjuje škodljive snovi. Čiščenje poteka preko adsorpcije odpadnih snovi na površino biofilma in mehanske filtracije, ki omogoča zadrževanje delcev v strukturi medija. Filtrirni medij omogoča imobilizacijo mikroorganizmov, njihovo rast in kolonizacijo. Najpogosteje se v ta namen uporablja polistirenska pena. Ker je hidrofobna, na njej nastajajo manj gosti biofilmi, zato je tudi sistem čiščenja manj učinkovit.
Te težave skuša odpraviti projekt TasAnchor. Z izbitjem gena ''tasA'' in ''sinR'' ter modifikacijo površinskega proteina TasA, so izboljšali njegovo adhezijo in sposobnost celic za tvorbo biofilma na polistirenu. Bakterijo ''Bacillus subtilis'' so imobilizirali na trdno površino.


'''ONESNAŽENJE S KADMIJEVIMI IONI'''
'''ONESNAŽENJE S KADMIJEVIMI IONI'''


Kadmij je toksična in obstojna težka kovina, ki predstavlja resno okoljsko tveganje. Onesaženje s kadmijem je še posebej resno, ker je ta rakotvoren in zato nevaren za zdravje ljudi. Ima dolgo razpolovno dobo in se težko izloči iz telesa.
Kadmij je toksična, obstojna in rakotvorna težka kovina, ki predstavlja resno okoljsko in zdravstveno tveganje. Da bi preverili funkcionalnost konstrukta TasAnchor, so ga uporabili za detekcijo, adsorpcijo in desorpcijo Cd²⁺ ionov.
Da bi preverili funkcionalnost konstrukta TasAnchor, so ga poskusili uporabiti pri detekciji onesnaženja s Cd2+ ter adsorpciji in desorpciji kovinskega iona.


'''SAMOUNIČEVALNI SISTEM'''
'''SAMOUNIČEVALNI SISTEM'''


Da bi preprečili nenadzorovano preživetje ali širjenje sistema TasAnchor, uporabljenega pri filtraciji težkih kovin, so zasnovali samouničevalni preklopni sistem, ki omogoča, da ''Bacillus subtilis'' umre, ko zapusti trden nosilec. Samouničevalno stikalo, ki so ga pripravili, deluje na osnovi zaznavanja celične gostote.
Za preprečevanje nenadzorovanega preživetja ali širjenja gensko spremenjenih bakterij so zasnovali samouničevalni sistem, ki omogoča, da Bacillus subtilis umre, ko zapusti trden nosilec. Ta sistem zaznava celično gostoto.


== Zasnova projekta in načrtovanje poskusov ==
== Načrtovanje, izvedba in rezultati eksperimentov ==


=== IZBITJE GENOV ''sinR''/''tasA'' ===
=== IZBITJE GENOV ''sinR''/''tasA'' ===


Protein TasA je amiloidni protein, ki pri bakteriji ''Bacillus subtilis'' predstavlja glavno komponento zunajceličnega matriksa biofilma. Protein SinR pa deluje kot regulator tvorbe biofilma. V tetramerni obliki se veže na operator epsA-O in tapA-sipW-tasA, s čimer zavira sintezo komponent biofilmskega matriksa, kot so zunajcelični polisaharidi in protein TasA.
Protein TasA je glavna komponenta zunajceličnega matriksa biofilma ''Bacillus subtilis'', kjer tvori vlaknaste strukture, ki prispevajo k boljši adheziji. Protein SinR pa deluje kot regulator tvorbe biofilma in zavira sintezo komponent matriksa. Z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 so iz genoma ''Bacillus subtilis'' 168 izbili gena ''tasA'' in ''sinR'', da bi povečali tvorbo biofilma.
Za modifikacijo biofilmskih proteinov pri gensko spremenjenih bakterijah in povečanje tvorbe biofilma so z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 in s homologno rekombinacijo iz genoma Bacillus subtilis 168 izbili gena tasA in sinR. V vektor pJOE8999 so z metodama z metodama kloniranja "Golden Gate" in homologne rekombinacije vstavili homologne roke in zaporedje usmerjevalne RNA, da so konstruirali CRISPR-Cas9 plazmid za izbijte genov.
V vektor pJOE8999 so vstavili zaporedji usmerjevalnih RNA, z njima transformirali bakterije ''Bacillus subtilis'' 168 in jih prenesli na gojišče s kanamicinom in 0,4-% manozo. S PCR in sekveniranjem so preverili, ali je v genomu bakterij prišlo do z manozo induciranega izbitja genov. Genski lokus ''sinR–tasA'' v bakteriji ''Bacillus subtilis'' je bil uspešno izbit, preostali deli zaporedja pa niso imeli delecij ali mutacij.
Šibkejše obarvanje biofilma bakterij z izbitima genoma z barvilom Kongo rdeče, ki se veže na vlakna TasA, je potrdilo odsotnost vlaken TasA in uspešno izbitje gena.
 


=== IZBOLJŠANJE ADHEZIJE BAKTERIJ NA NOSILEC ===
=== IZBOLJŠANJE ADHEZIJE BAKTERIJ NA NOSILEC ===


Protein TasA, kot glavna strukturna komponenta biofilmov bakterije Bacillus subtilis, ima sposobnost samosestavljanja. Izločeni monomeri TasA tvorijo vlaknaste strukture v zunajceličnem matriksu, ki imajo adhezivne lastnosti. Načrtovali so izboljšavo proteina TasA z dvema pristopoma: z ustvarjanjem fuzijskih proteinov TasA in z uporabo sistema SpyTag/SpyCatcher. Z izboljšavami so želeli povečati njegovo adsorpcijo na polistiren kot filtrirni medij v biofiltrih ter s tem omogočiti imobilizacijo celic na trdnih nosilcih.
Protein TasA tvori vlaknaste strukture v biofilmu, ki prispevajo k adheziji. Za izboljšanje vezave bakterij na trdne nosilce, kot je polistiren so zasnovali dva pristopa: fuzijske proteine TasA in sistem SpyTag/SpyCatcher.


'''FUZIJSKI PROTEINI'''
'''FUZIJSKI PROTEINI TasA'''


Da bi povečali adhezijsko sposobnost bakterij so za pripravo fuzijskih proteinov s TasA izbrali adhezijski protein Mfp5, ki omogoča trdno pritrjanje školjk na podvodne površine. Poleg interakcij s površino, verige Mfp5 interagirajo tudi med samo in tvorijo stabilno in dobro adhezivno mrežo.
Za pripravo fuzijskih proteinov TasA so izbrali adhezijski protein Mfp5, ki omogoča trdno pritrjevanje školjk, ter peptide, ki se specifično vežejo na polistiren (PS-tag1 in PS-tag2). Gene ''tasA'', ''mfp5'', ''PS-tag1'' in ''PS-tag2'' so vstavili v vektorje pHT01. Analiza z obarvanjem z barvilom Kongo rdeče je pokazala povečano ekspresijo proteina TasA pri sevih, ki so izražali TasA v fuziji s peptidi, ki vežejo polistiren. Ekspresija TasA je bila manjša pri fuzijskem proteinu TasA–Mfp5, verjetno zaradi velike molekulske mase, ki vpliva na sestavljanje in ekspresijo TasA.
Nato pa so za pripravo fuzijskih proteinov s TasA uporabili še peptide, ki imajo sposobnost specifične vezave na polistiren. Zasnovali so jih z uporabo metod "Evidence Deep Learning" (EDL) in "Biased Random-Key Genetic Algorithm" (BrKGA).


'''SISTEM ''SpyTag''/''SpyCatcher'' '''
Za preverjanje adhezijske sposobnosti TasA fuzijskih proteinov so bakterije z izbitimi geni, transformirane s pHT01-tasA, pHT01-tasA-mfp5, pHT01-tasA-PS-tag1 oziroma pHT01-tasA-PS-tag2, inkubirali s polistirenskimi kroglicami. Nato so z ultrazvočnim spiranjem odstranili pritrjene bakterije in preostalo suspenzijo nanesli na plošče in prešteli kolonije. Iz rezultatov je razvidno, da se je adhezijska sposobnost ''Bacillus subtilis'' z izraženimi TasA fuzijskimi proteini povečala v primerjavi s sevom, kjer se izraža TasA brez fuzije. Adhezija bakterij je bila najmočnejša pri fuzijskem proteinu TasA-Mfp5.


Velike fuzije, kot je TasA–Mfp5, lahko negativno vplivajo na sekrecijo in sposobnost samosestavljanja proteina TasA, kar lahko vodi do zmanjšane adhezijske sposobnosti. Da bi odpravili to težavo, so za inženiring proteina TasA uporabili sistem SpyTag/SpyCatcher, ki omogoča učinkovito kovalentno povezovanje proteinov preko stabilnih izopeptidnih vezi med peptidom SpyTag in proteinom SpyCatcher. Molekulska masa njegovih komponent je majhna, kar zmanjšuje vpliv na sekrecijsko učinkovitost in samosestavljanje TasA ter s tem ohranja njegovo adhezijsko funkcijo. Kot vezavni element so uporabili protein Mfp5, z zamenjavo tega adhezijskega proteinskega dela pa bi lahko adhezijo prilagodili različnim filtrirnim materialom.
Preverili so tudi adhezijo ''Bacillus subtilis'' z izraženim fuzijskim proteinom TasA-Mfp5 v okolju z visoko koncentracijo težkih kovin in nizkim pH, kakršno je okolje za čiščenje odpadnih voda. Bakterije z izbitima genoma in s plazmidom pHT01-tasA-mfp5 so inkubirali s polistirenskimi kroglicami, ultrazvočno sprali, prenesli na gojišče in prešteli kolonije. Z naraščanjem koncentracije Cd²⁺ se je adhezija nekoliko zmanjšala, pri pH 2 pa je bila rast bakterij močno inhibirana. Med pH 4–6 so bile razlike zanemarljive, kar kaže na stabilno adhezijo v tem območju.
 
 
'''SISTEM SpyTag/SpyCatcher'''
 
Velike fuzije, kot je TasA–Mfp5, lahko negativno vplivajo na sekrecijo in samosestavljanje proteina TasA, kar lahko vodi do zmanjšane adhezijske sposobnosti. Da bi odpravili to težavo, so uporabili sistem SpyTag/SpyCatcher, ki omogoča kovalentno povezovanje proteinov preko stabilnih izopeptidnih vezi med peptidom SpyTag in proteinom SpyCatcher. Zaradi majhne molekulske mase komponent ta sistem zmanjšuje vpliv na sekrecijo, samosestavljanje in adhezijo TasA.
 
Pripravili so plazmid pHT01-TasA-SpyTag za ekspresijo v ''Bacillus subtilis'' 168 in plazmid pET28(a)-Mfp5-SpyCatcher za ekspresijo v ''E. coli'' BL21[DE3].
 
Bakterije ''Bacillus subtilis'' so inkubirali z Mfp5-SpyCatcher in polistirenskimi kroglicami. Po spiranju so pokazali, da ima sistem SpyTag-SpyCatcher še boljšo adhezijo kot fuzijski protein TasA-Mfp5. Zaradi manjše molske mase in lažjega izločanja se na površini nahaja več molekul TasA-SpyTag in je posledično adhezija močnejša kot pri TasA-Mfp5. To so pokazali tudi z barvanjem TasA vlaken z barvilom Kongo rdeče.


=== SANACIJA ONESNAŽENJA S KADMIJEM ===
=== SANACIJA ONESNAŽENJA S KADMIJEM ===


Biosorpcija je pogosto uporabljena metoda za odstranjevanje težkih kovinskih ionov iz odpadnih voda. Za preverjanje učinkovitosti pritrjanja celic so izbrali sanacijo onesnaženja s Cd²⁺, toksično in obstojno težko kovino, ki predstavlja resno okoljsko tveganje.
Za odstranjevanje težkih kovinskih ionov iz odpadnih voda se pogosto uporablja biosorpcija. Za preverjanje učinkovitosti pritrjanja celic so izbrali sanacijo onesnaženja s Cd²⁺.


'''DETEKCIJA KADMIJA'''
'''DETEKCIJA KADMIJA'''


Za njegovo zaznavanje so zasnovali biosenzorski sistem na osnovi transkripcijskega faktorja CadR, ki specifično prepoznava in veže Cd²⁺ ter preko promotorja pCadR aktivira transkripcijo gena za mCherry. Gen cadR so modularno povezali z genom mCherry in s tem konstruirali orodje za specifično zaznavanje Cd²⁺ v odpadni vodi. Delovanje sistema so preverili z merjenjem intenzitete fluorescence pri različnih koncentracijah Cd²⁺.
Za zaznavanje kadmija so zasnovali biosenzorski sistem na osnovi transkripcijskega faktorja CadR, ki specifično prepoznava in veže Cd²⁺ ter preko promotorja pCadR aktivira transkripcijo gena za mCherry. V ta namen so konstruirali plazmid pHT01-epcadR-pcadR-mcherry in z njim transformirali ''Bacillus subtilis'' z izbitima genoma.
 
Intenziteta fluorescence inženirskih sevov je pokazala pozitivno korelacijo s koncentracijo kadmija in časom inkubacije, kar potrjuje učinkovito indukcijo fluorescentnega izražanja s kadmijevimi ioni.


'''ADSORPCIJA KADMIJA'''
'''ADSORPCIJA KADMIJA'''


Za specifično in učinkovito adsorpcijo Cd²⁺so uporabili metalotionein SmtA iz cianobakterij. Zasnovali so fuzijski protein SmtA–TasA, ki omogoča obnovo tvorbe biofilma ter hkratno adsorpcijo in zajemanje Cd²⁺, s čimer se zmanjša njegova koncentracija v odpadni vodi. Kadmijevi ioni se adsorbirajo na SmtA preko njegovih funkcionalnih skupin. V kislem okolju pa H+ ioni tekmujejo za vezavo na funkcionalne skupine in izmenjajo težke kovinske ione. Adsorpcijsko učinkovitosti in potrdili toleranco seva na Cd²⁺ so preverili z analizo tvorbe biofilma in preostale koncentracijo Cd²⁺ v obdelani vodi pri različnih koncentracijah Cd²⁺.
Za specifično adsorpcijo Cd²⁺ so uporabili metalotionein SmtA iz cianobakterij. Zasnovali so fuzijski protein SmtA–TasA, ki omogoča tvorbo biofilma ter adsorpcijo in zajemanje Cd²⁺. Adsorpcijska učinkovitost je bila preverjena z analizo preostale koncentracije Cd²⁺ v obdelani vodi.
 
Izmerili so adsorpcijsko in desorpcijsko sposobnost proteina SmtA. Pri visokem pH so vezavna mesta deprotonirana, kar omogoča vezavo Cd²⁺, medtem ko pri nizkem pH protonacija spodbuja desorpcijo in sproščanje kadmijevih ionov. Inženirski sev s plazmidom pHT01-tasA-smtA so testirali v zaporednih ciklih in pokazali visoko in stabilno adsorpcijsko sposobnost (skoraj 100 % odstranitev pri 9 mg/L). Desorpcija ni bila popolna, vendar je sev ohranil visoko učinkovitost adsorpcije. Pri nižji koncentraciji (5 mg/L) je bila desorpcija zelo učinkovita (do 100 %), kar kaže na dobro obnovitveno sposobnost.


=== ZAZNAVANJE CELIČNE GOSTOTE ===
'''DETEKCIJA IN ADHEZIJA'''


Za preprečevanje nenadzorovanega preživetja ali širjenja sistema TasAnchor so na osnovi poti ComQXPA in sistema toksin–antitoksin mazEF zasnovali samouničevalni sistem zaznavanja celične gostote.
Za sočasno adhezijo in detekcijoCd²⁺ so konstruirali senzorno-adhezijski plazmid, ki združuje adhezijski protein Mfp5 (v fuziji TasA–Mfp5) z genskim konstruktom epcadR-pcadR-mcherry. Uporabili so močan konstitutivni promotor p43 in pripravili plazmid pHT01-p43-epcadR-mcherry-p43-tasA-mfp5. Polistirenske kroglice s pritrjenimi celicami tega seva so po indukciji s kadmijevimi ioni pokazale izrazito rdečo fluorescenco. To potrjuje, da sev hkrati omogoča adhezijo na kroglice in fluorescenčni odziv na kadmij.
Gensko spremenjene bakterije pritrjene na trden medij so v okolju z visoko celično gostoto. Signalni peptid ComX preko ComX poti aktivira promotor PsrfA, kar sproži izražanje proteina LacI. LacI zavira promotor Pgrac in s tem preprečuje izražanje toksina MazF, kar omogoča preživetje celic. Ko bakterije zapustijo nosilec, se gostota populacije zmanjša. Koncentracija ComX pade, PsrfA postane neaktiven, izražanje LacI se ustavi, MazF pa se sprosti, kar vodi do aktivacije toksina in celične smrti. Gen za antitoksin MazE, ki ga poganja promotor p43, pa zagotavlja začasno zaščito in zmanjšuje toksičnost zaradi morebitnega puščanja izražanja MazF pri visoki gostoti celic.
Preverili so odzivnost promotorja PsrfA na celično gostoto, citotoksičnost proteina MazF ter zaščitni učinek MazE.


== Rezultati ==
Za končni cilj adhezije na biološki filtrirni material in adsorpcije Cd²⁺ so načrtovali konstrukcijo ekspresijskega adsorpcijsko-adhezijskega plazmida pHT01-p43-tasA-smtA-p43-tasA-mfp5. Vendar so ugotovili, da sočasna ekspresija dveh TasA fuzijskih proteinov močno zavira rast seva in zmanjša transformacijsko učinkovitost.


=== SAMOUNIČEVALNI SISTEM NA OSNOVI ZAZNAVANJA CELIČNE GOSTOTE ===
Za preprečevanje nenadzorovanega širjenja gensko spremenjenih bakterij so razvili samouničevalni sistem, ki temelji na poti ComQXPA in sistemu toksin–antitoksin mazEF. Ta sistem omogoča preživetje bakterij pri visoki celični gostoti na nosilcih, ob zmanjšanju gostote in sprostitvi v okolje pa se aktivira samouničenje.
Signalni peptid ComX se pri visoki celični gostoti kopiči in preko kaskade ComP–ComA inducira promotor PsrfA, ki sproži izražanje proteina LacI. LacI zavira promotor Pgrac, kar preprečuje izražanje toksina MazF in omogoča preživetje celic. Ko se bakterije sprostijo v okolje, koncentracija ComX pade, PsrfA postane neaktiven, izražanje LacI se ustavi, MazF pa se sprosti, kar povzroči celično smrt. Antitoksin MazE zagotavlja zaščito zaščito in zmanjšuje toksičnost zaradi morebitnega puščanja izražanja MazF pri visoki gostoti celic.
Preverili so odzivnost promotorja PsrfA na celično gostoto, citotoksičnost proteina MazF in zaščitni učinek MazE. Merjenje fluorescence in OD600 je pokazalo, da ima promotor prag aktivacije odvisen od gostote celic, kar omogoča, da se sistem samouničenja natančno odziva na spremembe populacije bakterij v reaktorju.
'''MazF toksin'''
MazF je toksin in protein v sistemu toksin–antitoksin mazF/mazE in deluje kot mRNA endonukleaza. Konstruirali so plazmid pHT01-mazF (lacO/lacI, pGrac, mazF) in transformirali bakterijo ''Bacillus subtilis''. Indukcija izražanja toksina MazF z IPTG je potrdila njegovo baktericidno delovanje, saj se je s povečevanjem koncentracije IPTG število kolonij zmanjšalo.
'''MazE antitoksin'''
Da bi inženirske bakterije preživele pri visoki gostoti z morebitno nizko bazalno ekspresijo toksina MazF, so antitoksin MazE pod promotorjem p43 uvedli za nevtralizacijo MazF. Konstruirali so plazmid pHT01-PGrac-mazF-P43-mazE. Rezultati so pokazali, da konstitutivno izražen MazE le delno nevtralizira učinek toksina. MazE učinkovito inhibira MazF pri nizkih ravneh izražanja, kar omogoča regulirano izražanje toksina MazF in stabilnost bakterij.


== Zaključek ==
== Zaključek ==


V projektu so uspešno zasnovali sistem za čiščenje odpadnih voda na osnovi ''Bacillus subtilis''. Z izbitjem genov ''sinR'' in ''tasA'' ter uvedbo fuzijskih proteinov in sistema SpyTag/SpyCatcher so izboljšali tvorbo biofilma in adhezijo na polistiren. Razvili so biosenzor za zaznavanje Cd²⁺ ter učinkovit sistem za adsorpcijo in desorpcijo kadmija. Poleg tega so vzpostavili samouničevalni sistem, ki zagotavlja biološko varnost. Rezultati potrjujejo potencial bakterij za integrirano bioremediacijo, vendar ostajajo izzivi pri stabilnosti, metabolni obremenitvi in sočasni ekspresiji več konstruktov.


== Viri ==
== Viri ==
https://2025.igem.wiki/scu-china/
https://2025.igem.wiki/scu-china/


https://teams.igem.org/5810
https://teams.igem.org/5810

Revision as of 13:05, 4 May 2026

TasAnchor je iGEM projekt ekipe SCU-China s Kitajske iz leta 2025. Skupina je zasedla 1. mesto na področju bioremediacije.

Uvod

Gensko spremenjene bakterije imajo velik potencial za čiščenje industrijskih odpadnih voda, saj lahko zaznavajo, adsorbirajo in razgrajujejo škodljive snovi v vodi, kot so sintetična barvila, težke kovine in agrokemikalije.

PREHITRO IZPIRANJE BIOFILMA

Ena glavnih ovir pri uporabi gensko spremenjenih bakterij je prehitro izpiranje biofilma, njegova slaba stabilnost in nizka celična gostota v praktičnih pogojih. Visoka hidravlična obremenitev v čistilnih napravah izpere mikroorganizme hitreje, kot se ti lahko razmnožujejo, kar zmanjša učinkovitost čiščenja. Biofilmi so ključni za proces čiščenja odpadnih voda, saj omogočajo adsorpcijo in mehansko filtracijo. Filtrirni medij, kot je polistirenska pena, omogoča imobilizacijo mikroorganizmov, vendar je zaradi hidrofobnosti pene nastal biofilm manj gost. Projekt TasAnchor rešuje ta problem z izboljšanjem adhezije in sposobnosti celic za tvorbo biofilma na polistirenu z izbitjem genov tasA in sinR ter modifikacijo površinskega proteina TasA v bakteriji Bacillus subtilis.

ONESNAŽENJE S KADMIJEVIMI IONI

Kadmij je toksična, obstojna in rakotvorna težka kovina, ki predstavlja resno okoljsko in zdravstveno tveganje. Da bi preverili funkcionalnost konstrukta TasAnchor, so ga uporabili za detekcijo, adsorpcijo in desorpcijo Cd²⁺ ionov.

SAMOUNIČEVALNI SISTEM

Za preprečevanje nenadzorovanega preživetja ali širjenja gensko spremenjenih bakterij so zasnovali samouničevalni sistem, ki omogoča, da Bacillus subtilis umre, ko zapusti trden nosilec. Ta sistem zaznava celično gostoto.

Načrtovanje, izvedba in rezultati eksperimentov

IZBITJE GENOV sinR/tasA

Protein TasA je glavna komponenta zunajceličnega matriksa biofilma Bacillus subtilis, kjer tvori vlaknaste strukture, ki prispevajo k boljši adheziji. Protein SinR pa deluje kot regulator tvorbe biofilma in zavira sintezo komponent matriksa. Z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 so iz genoma Bacillus subtilis 168 izbili gena tasA in sinR, da bi povečali tvorbo biofilma. V vektor pJOE8999 so vstavili zaporedji usmerjevalnih RNA, z njima transformirali bakterije Bacillus subtilis 168 in jih prenesli na gojišče s kanamicinom in 0,4-% manozo. S PCR in sekveniranjem so preverili, ali je v genomu bakterij prišlo do z manozo induciranega izbitja genov. Genski lokus sinR–tasA v bakteriji Bacillus subtilis je bil uspešno izbit, preostali deli zaporedja pa niso imeli delecij ali mutacij. Šibkejše obarvanje biofilma bakterij z izbitima genoma z barvilom Kongo rdeče, ki se veže na vlakna TasA, je potrdilo odsotnost vlaken TasA in uspešno izbitje gena.


IZBOLJŠANJE ADHEZIJE BAKTERIJ NA NOSILEC

Protein TasA tvori vlaknaste strukture v biofilmu, ki prispevajo k adheziji. Za izboljšanje vezave bakterij na trdne nosilce, kot je polistiren so zasnovali dva pristopa: fuzijske proteine TasA in sistem SpyTag/SpyCatcher.

FUZIJSKI PROTEINI TasA

Za pripravo fuzijskih proteinov TasA so izbrali adhezijski protein Mfp5, ki omogoča trdno pritrjevanje školjk, ter peptide, ki se specifično vežejo na polistiren (PS-tag1 in PS-tag2). Gene tasA, mfp5, PS-tag1 in PS-tag2 so vstavili v vektorje pHT01. Analiza z obarvanjem z barvilom Kongo rdeče je pokazala povečano ekspresijo proteina TasA pri sevih, ki so izražali TasA v fuziji s peptidi, ki vežejo polistiren. Ekspresija TasA je bila manjša pri fuzijskem proteinu TasA–Mfp5, verjetno zaradi velike molekulske mase, ki vpliva na sestavljanje in ekspresijo TasA.

Za preverjanje adhezijske sposobnosti TasA fuzijskih proteinov so bakterije z izbitimi geni, transformirane s pHT01-tasA, pHT01-tasA-mfp5, pHT01-tasA-PS-tag1 oziroma pHT01-tasA-PS-tag2, inkubirali s polistirenskimi kroglicami. Nato so z ultrazvočnim spiranjem odstranili pritrjene bakterije in preostalo suspenzijo nanesli na plošče in prešteli kolonije. Iz rezultatov je razvidno, da se je adhezijska sposobnost Bacillus subtilis z izraženimi TasA fuzijskimi proteini povečala v primerjavi s sevom, kjer se izraža TasA brez fuzije. Adhezija bakterij je bila najmočnejša pri fuzijskem proteinu TasA-Mfp5.

Preverili so tudi adhezijo Bacillus subtilis z izraženim fuzijskim proteinom TasA-Mfp5 v okolju z visoko koncentracijo težkih kovin in nizkim pH, kakršno je okolje za čiščenje odpadnih voda. Bakterije z izbitima genoma in s plazmidom pHT01-tasA-mfp5 so inkubirali s polistirenskimi kroglicami, ultrazvočno sprali, prenesli na gojišče in prešteli kolonije. Z naraščanjem koncentracije Cd²⁺ se je adhezija nekoliko zmanjšala, pri pH 2 pa je bila rast bakterij močno inhibirana. Med pH 4–6 so bile razlike zanemarljive, kar kaže na stabilno adhezijo v tem območju.


SISTEM SpyTag/SpyCatcher

Velike fuzije, kot je TasA–Mfp5, lahko negativno vplivajo na sekrecijo in samosestavljanje proteina TasA, kar lahko vodi do zmanjšane adhezijske sposobnosti. Da bi odpravili to težavo, so uporabili sistem SpyTag/SpyCatcher, ki omogoča kovalentno povezovanje proteinov preko stabilnih izopeptidnih vezi med peptidom SpyTag in proteinom SpyCatcher. Zaradi majhne molekulske mase komponent ta sistem zmanjšuje vpliv na sekrecijo, samosestavljanje in adhezijo TasA.

Pripravili so plazmid pHT01-TasA-SpyTag za ekspresijo v Bacillus subtilis 168 in plazmid pET28(a)-Mfp5-SpyCatcher za ekspresijo v E. coli BL21[DE3].

Bakterije Bacillus subtilis so inkubirali z Mfp5-SpyCatcher in polistirenskimi kroglicami. Po spiranju so pokazali, da ima sistem SpyTag-SpyCatcher še boljšo adhezijo kot fuzijski protein TasA-Mfp5. Zaradi manjše molske mase in lažjega izločanja se na površini nahaja več molekul TasA-SpyTag in je posledično adhezija močnejša kot pri TasA-Mfp5. To so pokazali tudi z barvanjem TasA vlaken z barvilom Kongo rdeče.

SANACIJA ONESNAŽENJA S KADMIJEM

Za odstranjevanje težkih kovinskih ionov iz odpadnih voda se pogosto uporablja biosorpcija. Za preverjanje učinkovitosti pritrjanja celic so izbrali sanacijo onesnaženja s Cd²⁺.

DETEKCIJA KADMIJA

Za zaznavanje kadmija so zasnovali biosenzorski sistem na osnovi transkripcijskega faktorja CadR, ki specifično prepoznava in veže Cd²⁺ ter preko promotorja pCadR aktivira transkripcijo gena za mCherry. V ta namen so konstruirali plazmid pHT01-epcadR-pcadR-mcherry in z njim transformirali Bacillus subtilis z izbitima genoma.

Intenziteta fluorescence inženirskih sevov je pokazala pozitivno korelacijo s koncentracijo kadmija in časom inkubacije, kar potrjuje učinkovito indukcijo fluorescentnega izražanja s kadmijevimi ioni.

ADSORPCIJA KADMIJA

Za specifično adsorpcijo Cd²⁺ so uporabili metalotionein SmtA iz cianobakterij. Zasnovali so fuzijski protein SmtA–TasA, ki omogoča tvorbo biofilma ter adsorpcijo in zajemanje Cd²⁺. Adsorpcijska učinkovitost je bila preverjena z analizo preostale koncentracije Cd²⁺ v obdelani vodi.

Izmerili so adsorpcijsko in desorpcijsko sposobnost proteina SmtA. Pri visokem pH so vezavna mesta deprotonirana, kar omogoča vezavo Cd²⁺, medtem ko pri nizkem pH protonacija spodbuja desorpcijo in sproščanje kadmijevih ionov. Inženirski sev s plazmidom pHT01-tasA-smtA so testirali v zaporednih ciklih in pokazali visoko in stabilno adsorpcijsko sposobnost (skoraj 100 % odstranitev pri 9 mg/L). Desorpcija ni bila popolna, vendar je sev ohranil visoko učinkovitost adsorpcije. Pri nižji koncentraciji (5 mg/L) je bila desorpcija zelo učinkovita (do 100 %), kar kaže na dobro obnovitveno sposobnost.

DETEKCIJA IN ADHEZIJA

Za sočasno adhezijo in detekcijoCd²⁺ so konstruirali senzorno-adhezijski plazmid, ki združuje adhezijski protein Mfp5 (v fuziji TasA–Mfp5) z genskim konstruktom epcadR-pcadR-mcherry. Uporabili so močan konstitutivni promotor p43 in pripravili plazmid pHT01-p43-epcadR-mcherry-p43-tasA-mfp5. Polistirenske kroglice s pritrjenimi celicami tega seva so po indukciji s kadmijevimi ioni pokazale izrazito rdečo fluorescenco. To potrjuje, da sev hkrati omogoča adhezijo na kroglice in fluorescenčni odziv na kadmij.

Za končni cilj adhezije na biološki filtrirni material in adsorpcije Cd²⁺ so načrtovali konstrukcijo ekspresijskega adsorpcijsko-adhezijskega plazmida pHT01-p43-tasA-smtA-p43-tasA-mfp5. Vendar so ugotovili, da sočasna ekspresija dveh TasA fuzijskih proteinov močno zavira rast seva in zmanjša transformacijsko učinkovitost.


SAMOUNIČEVALNI SISTEM NA OSNOVI ZAZNAVANJA CELIČNE GOSTOTE

Za preprečevanje nenadzorovanega širjenja gensko spremenjenih bakterij so razvili samouničevalni sistem, ki temelji na poti ComQXPA in sistemu toksin–antitoksin mazEF. Ta sistem omogoča preživetje bakterij pri visoki celični gostoti na nosilcih, ob zmanjšanju gostote in sprostitvi v okolje pa se aktivira samouničenje.

Signalni peptid ComX se pri visoki celični gostoti kopiči in preko kaskade ComP–ComA inducira promotor PsrfA, ki sproži izražanje proteina LacI. LacI zavira promotor Pgrac, kar preprečuje izražanje toksina MazF in omogoča preživetje celic. Ko se bakterije sprostijo v okolje, koncentracija ComX pade, PsrfA postane neaktiven, izražanje LacI se ustavi, MazF pa se sprosti, kar povzroči celično smrt. Antitoksin MazE zagotavlja zaščito zaščito in zmanjšuje toksičnost zaradi morebitnega puščanja izražanja MazF pri visoki gostoti celic.

Preverili so odzivnost promotorja PsrfA na celično gostoto, citotoksičnost proteina MazF in zaščitni učinek MazE. Merjenje fluorescence in OD600 je pokazalo, da ima promotor prag aktivacije odvisen od gostote celic, kar omogoča, da se sistem samouničenja natančno odziva na spremembe populacije bakterij v reaktorju.

MazF toksin

MazF je toksin in protein v sistemu toksin–antitoksin mazF/mazE in deluje kot mRNA endonukleaza. Konstruirali so plazmid pHT01-mazF (lacO/lacI, pGrac, mazF) in transformirali bakterijo Bacillus subtilis. Indukcija izražanja toksina MazF z IPTG je potrdila njegovo baktericidno delovanje, saj se je s povečevanjem koncentracije IPTG število kolonij zmanjšalo.

MazE antitoksin

Da bi inženirske bakterije preživele pri visoki gostoti z morebitno nizko bazalno ekspresijo toksina MazF, so antitoksin MazE pod promotorjem p43 uvedli za nevtralizacijo MazF. Konstruirali so plazmid pHT01-PGrac-mazF-P43-mazE. Rezultati so pokazali, da konstitutivno izražen MazE le delno nevtralizira učinek toksina. MazE učinkovito inhibira MazF pri nizkih ravneh izražanja, kar omogoča regulirano izražanje toksina MazF in stabilnost bakterij.

Zaključek

V projektu so uspešno zasnovali sistem za čiščenje odpadnih voda na osnovi Bacillus subtilis. Z izbitjem genov sinR in tasA ter uvedbo fuzijskih proteinov in sistema SpyTag/SpyCatcher so izboljšali tvorbo biofilma in adhezijo na polistiren. Razvili so biosenzor za zaznavanje Cd²⁺ ter učinkovit sistem za adsorpcijo in desorpcijo kadmija. Poleg tega so vzpostavili samouničevalni sistem, ki zagotavlja biološko varnost. Rezultati potrjujejo potencial bakterij za integrirano bioremediacijo, vendar ostajajo izzivi pri stabilnosti, metabolni obremenitvi in sočasni ekspresiji več konstruktov.

Viri

https://2025.igem.wiki/scu-china/

https://teams.igem.org/5810

Retrieved from "https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TasAnchor&oldid=25997"