Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

Uvod

Sintezna biologija od spodaj navzgor

Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav. V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

Namen raziskave

Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje vse potrebne komponente za potek transkripcije in translacije. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini. Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

Priprava sinteznih celic

Zasnova membrane in uporaba RdLPS

Za uspešno okužbo sintetičnih celic je bil ključen nastanek liposomov, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravnem gostitelju, bakteriji E. coli, so receptorji za bakteriofage pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. V tej raziskavi je bil kot receptorska komponenta uporabljen RdLPS, krajša oblika grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Zaradi manjše velikosti in večje hidrofobnosti je primernejši za stabilno vključitev v lipidno membrano liposoma kot daljše oblike LPS.

Vključitev LPS v membrano liposoma predstavlja tehnični izziv. LPS ima veliko molekulsko maso in se slabše ujema s fosfolipidi, ki tvorijo osnovo membrane. Za delovanje sistema je bila pomembna tudi pravilna orientacija RdLPS. Receptor je moral biti prisoten predvsem v zunanjem lističu membrane, saj tam omogoča vezavo faga T7. Večja prisotnost RdLPS na notranji strani membrane bi lahko povzročila neželeno inaktivacijo novo nastalih fagov znotraj sintetične celice.

Membrana sintetičnih celic je bila sestavljena iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo lipidne membrane, PE-PEG je zmanjšal agregacijo liposomov in izboljšal njihovo stabilnost, RdLPS pa je omogočil specifično vezavo faga T7. Kot najprimernejša sestava se je pokazalo razmerje PC/PE-PEG/LPS = 55/15/30 mol % pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S takšno sestavo so nastali stabilni liposomi s premeri od 1 do 50 µm.

Preverjanje delovanja membrane z RdLPS

RdLPS v membrani ni bil pomemben samo kot strukturna komponenta, ampak predvsem kot funkcionalen receptor za fag T7. Njegovo delovanje je bilo preverjeno s himernim proteinom GFP-TF*, ki vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Vezava GFP-TF* na membrano zato pomeni, da je RdLPS pravilno vgrajen in dostopen na površini liposoma.

Fluorescenčni signal GFP-TF* se je pojavil samo na liposomih z RdLPS, ne pa na liposomih brez RdLPS. To potrjuje specifičnost vezave in kaže, da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini sintetičnih celic. Pomembna ugotovitev je tudi, da prisotnost RdLPS v membrani ni zavrla delovanja celično-prostega sistema izražanja genov, CFE, v notranjosti liposomov. Aktivnost CFE sistema je bila potrjena z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Dodatno potrditev delovanja receptorja je omogočil inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag vsebuje repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, hkrati pa omogoča fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

Vstop in izražanje fagnega genoma

Vstop fagnega genoma in izražanje mCherry

Specifična vezava faga T7 na sintetične celice še ne pomeni nujno, da fag v celico tudi vnese svoj genom. Pri T7 je vstop genoma poseben, ker ima fag kratek nekrčljiv rep. Za razliko od fagov z daljšimi strukturami T7 membrane ne prebode neposredno z repom. Pri prenosu DNA sodelujejo notranji jedrni proteini, ki pomagajo oblikovati kanal za prehod genoma.

Vstop genoma je bil preverjen z inženiranima fagoma T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta vsebovala zapis za reporterski protein mCherry, razlikovala pa sta se v sposobnosti vezave na RdLPS. T7-mC-S* je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa te sposobnosti ni imel. Logika poskusa je temeljila na tem, da se ob uspešnem vstopu fagnega genoma v liposomu začne izražati mCherry, kar povzroči rdečo fluorescenco.

Rdeč fluorescenčni signal se je pojavil samo pri sintetičnih celicah, izpostavljenih fagu T7-mC-S*. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki niso imeli sposobnosti specifične vezave na RdLPS ali niso vsebovali ustreznega reporterja, niso povzročili signala nad ozadjem. Vstop genoma je bil zato specifično odvisen od receptorja RdLPS.

Vpliv MOI in velikosti liposomov

Učinkovitost okužbe je bila močno odvisna od MOI, torej razmerja med številom infektivnih fagov in številom sintetičnih celic. Pri MOI približno 3 je bilo okuženih manj kot 2 % sintetičnih celic. Pri MOI 300 pa je delež okuženih celic narasel na skoraj 70 %. To kaže, da je za učinkovito okužbo v tem sistemu potrebna razmeroma visoka koncentracija fagov.

Na izražanje mCherry je vplivala tudi velikost liposomov. Manjši liposomi, s premerom pod 10 µm, so imeli višjo koncentracijo mCherry kot večji liposomi. Ta učinek je najverjetneje povezan z razmerjem med površino in volumnom. Pri manjšem liposomu že manjše število vnesenih genomov povzroči višjo koncentracijo DNA v notranjosti, zato je tudi fluorescenčni signal močnejši.

Kinetika, sestavljanje in sprostitev fagov

Čas vstopa genoma in nastajanje infektivnih delcev

Čas vstopa genoma v sintetične celice je bil ocenjen s primerjavo dveh pogojev: v prvem je bil fagni genom že prisoten v notranjosti liposoma, v drugem pa je moral genom vstopiti iz zunanje raztopine. Razlika v začetku fluorescenčnega signala je pokazala, da prenos genoma T7 v tem sistemu traja približno od 100 do 105 minut.

Nastajanje infektivnih fagov je bilo spremljano z meritvijo PFU na nanoliter. PFU pomeni plaque-forming units, torej število infektivnih fagnih delcev, ki lahko tvorijo plake na bakterijski plasti. Prvi infektivni fagi so bili zaznani po približno eni uri. Po dveh urah je bilo doseženih več kot 50 % končnega titra, po petih urah pa približno 10⁵ PFU/nL. Pri 30 °C so bili titri v masni CFE reakciji in v sintetičnih celicah podobni.

Izmerjeni titri so bili nekoliko višji od vrednosti, pričakovane v primeru, da bi se vsak začetni genom samo enkrat zapakiral brez dodatne replikacije. To kaže na delno pomnoževanje DNA v sintetičnih celicah. Ocenjeni faktor replikacije je bil približno 1,5, kar je manj kot v bakterijskem gostitelju, vendar potrjuje, da sistem omogoča vsaj omejeno replikacijo fagnega genoma.

Sestavljanje fagov in vpliv RdLPS

Sinteza fagov v liposomih je bila pri najnižji koncentraciji DNA, 10 pM, celo učinkovitejša kot v masni CFE reakciji. Verjetna razlaga je prostorska omejitev liposoma, kjer so DNA, encimi, ribosomi in nastajajoči proteinski produkti lokalno bolj zbrani. Pri višjih koncentracijah DNA sta bila liposomski in masni sistem bolj primerljiva.

Pomembna omejitev sistema je bila ponovna vezava novo nastalih fagov na RdLPS. Pri fagih, ki se močno vežejo na RdLPS, je bilo zaznano približno 94 % zmanjšanje prostih infektivnih delcev. To ne pomeni, da se fagi niso sestavili. Bolj verjetno je, da so se po nastanku ireverzibilno vezali na RdLPS in zato niso bili več zaznani kot prosti infektivni delci. RdLPS je tako nujen za vstop genoma, hkrati pa lahko zmanjša razpoložljivost potomnih fagov.

Sprostitev fagov

Naravni litični cikel bakteriofagov se konča z lizo gostiteljske celice. Pri bakterijah pri tem sodelujejo endolizini, holini in spanini, nato pa osmotski tlak povzroči razpad celice. V sintetičnih celicah spontana liza ni bila učinkovita. Glavni razlog je, da so bili liposomi v izotoničnih pogojih in nimajo bakterijske celične stene. Naravni litični mehanizem zato v takšnem sistemu ne deluje enako kot v bakteriji.

Sprostitev fagov je bila dosežena z osmotskim šokom. Sintetične celice so se razgradile po prenosu iz izosmotskega v hipoosmotsko okolje. Primerjava aktivnih sintetičnih celic z mrtvimi celicami, ki so vsebovale RNazo A, je pokazala veliko razliko v nastajanju fagov. Aktivne sintetične celice so proizvedle približno 81-krat več fagov na vezikel kot mrtve celice. Ta rezultat potrjuje, da fagi nastajajo zaradi aktivne transkripcije, translacije, replikacije in sestavljanja v notranjosti liposomov, ne zgolj zaradi vezave začetnih fagov na membrano.

Pomen raziskave in aključek

Glavna ugotovitev raziskave je, da je mogoče v celično-prostem sistemu sintetičnih celic združiti vse ključne korake fagnega infekcijskega cikla. Sistem omogoča vezavo faga T7 na membrano, vstop genoma, izražanje genov, replikacijo DNA, sestavljanje novih infektivnih delcev in njihovo sprostitev po osmotskem šoku.

Raziskava ima pomemben pomen za sintezno biologijo, ker kaže, da je mogoče kompleksen virusni cikel rekonstruirati iz osnovnih molekularnih komponent. Sistem je dovolj poenostavljen, da omogoča nadzorovano preučevanje posameznih korakov okužbe, hkrati pa dovolj kompleksen, da vključuje glavne značilnosti naravnega fagnega cikla.

Literatura

[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8