Molekulsko kloniranje

Predmet 3. letnika študijskega programa Biokemija. Izvaja se v zimskem semestru. Ima 30 h predavanj, 5 h seminarjev in 40 h laboratorijskih vaj, skupaj 5 kreditnih točk ECTS.

Nosilec predmeta: izr. prof. dr. Marko Dolinar.

Vaje so ključni del predmeta, zato se izvajajo v majhnih skupinah. Izpitni roki (dva v zimskem in po en v poletnem in jesenskem izpitnem obdobju) vključujejo snov predavanj in vaj. Za snov z vaj pisnemu delu sledi ustni del, ki ga opravite pri svojem asistentu.

Teme predavanj

1. Kloniranje, pojem biološke varnosti in omejitve pri delu.
2. Zgodovina molekularne biotehnologije. Laboratorijski organizmi.
3. Encimi pri delu z DNA.
4. Elektroforezne metode.
5. Vektorske molekule. Reporterski geni.
6. Sinteza DNA in vitro. Sinteza cDNA. Priprava DNA-knjižnic. Transformiranje celic.
7. PCR in izvedene tehnike.
8. Hibridizacija, sonde, načini označevanja DNA. Presejanje knjižnic.
9. Določanje nukleotidnega zaporedja DNA (dideoksi-metoda).
10. Ekspresijski sistemi. Transkripcija/translacija in vitro.
11. Izražanje v prokariontih: vektorji, fuzije, optimizacija proizvodnje. Usmerjena lokalizacija, topnost, stabilnost, renaturacija.
12. Izražanje v kvasovkah, insektnih in sesalskih celicah.

Seminarji

Seminarji bodo vključeni v termine predavanj. Če bo čas, bomo obdelali nekatere ključne dosežke iz zgodovine molekulskega kloniranja. Posebna tema seminarjev - za delo doma - so ocene tveganja za delo z GSO. S temi seminarji dobite 5 % končne ocene predmeta.

Vsak študent bo dobil svojo kombinacijo gostiteljskega organizma, vektorja in vključka, svojo lokacijo predvidenega zaprtega sistema in namen dela. Na osnovi teh parametrov, ki jih boste dobili po e-pošti, ko zanje zaprosite, boste pripravili kratko oceno tveganja (predvidoma okrog 4 strani) in mi jo poslali po e-pošti.

V oceni tveganja (seminarju) označite z modro tiste dele, ki izhajajo iz predloge oz. ki so v pretežni meri prepisani od drugod. Z zeleno označite tiste dele, ki ste jih sestavili v sodelovanju s kolegi (spodaj navedite, kdo vse je sodeloval). Ni nujno, da npr. tisti, ki ste dobili enak gostiteljski organizem, skupaj sestavite en del ocene tveganja, lahko pa tako naredite. S črno pustite besedilo, ki je izključno vaše. Besedilo, pri katerem se sklicujete na nek vir, a ste ga napisali sami, naj bo napisano s črno, ne z modro.

Seminar mi lahko pošljete po e-pošti kadar koli, lahko tudi po tem, ko opravite izpit in kolokvij. Za pregled in oceno rabim nekaj dni, zato mi je ne pošiljajte tik pred zaključkom študija. Če boste seminar oddali še preden boste opravili izpit, boste oceno dobili skupaj z izpitno.

Vzorčna ocena tveganja je v spletni učilnici.

Teme laboratorijskih vaj

Navodila za vaje boste dobili pred začetkom vaj v formatu PDF. Teme vaj bodo:

1. Primerjava dveh metod za izolacijo plazmidne DNA, vloga dodatkov, agarozna elektroforeza.
2. Načrtovanje začetnih oligonukleotidov, konstruiranje rekombinantnih molekul (računalniška vaja).
3. Izolacija plazmidne DNA v srednjem merilu in ocena koncentracije.
4. Preparativno rezanje plazmidne DNA z restriktazami.
5. Izolacija DNA iz agaroznega gela.
6. Priprava kompetentnih celic.
7. Ligacija fragmentov DNA in transformacija bakterij. Analiza transformant.
8. Indukcija izražanja rekombinantne DNA.
9. Analiza topnosti rekombinantnega proteina. Lokalizacija rekombinantnega proteina in test biološke aktivnosti.

Vaje bodo dvakrat tedensko po 5 ur in bodo trajale 5 oz. 6 tednov. V vsaki skupini bo največ 10 študentov.

Izpitni roki

Izpitni roki v študijskem letu 2012/13 bodo:

• 30.1.2013
• 14.2.2012
• 28.6.2012
• 23.8.2012

Ocenjevanje

Ocena je sestavljena iz 5 % za seminar, 10 % za poročila z vaj, 35 % za kolokvij z vaj in 50 % za teorijo. Izpit je pisni in ustni. Pogoj za opravljen izpit je, da iz teorije dosežete najmanj 50 % točk, da ste pripravili seminar, bili na vseh vajah in ste oddali poročila z vaj. Meje med ocenami bodo: do 9 % 1, do 19 % 2, do 29 % 3, do 39 % 4, do 48 % 5, do 58 % 6, do 68 % 7, do 77 % 8, do 86 % 9, 87 % ali več 10. Če se kdo prijavi na izpit, pa se potem ne odjavi, ne vračam prijavnice, vas pa odjavim, če to odločitev sporočite do trenutka, ko dobite v roke izpitna vprašanja oziroma po e-pošti do razpisane ure izpita.
Ocena za vaje je sestavljena iz pisnega dela (pišete hkrati s teorijo) in iz ustnega dela. Prvi del šteje 6/10, drugi pa 4/10 tistege dela ocene, ki zajema znanje z vaj (35 %).
Teoretično bi se lahko zgodilo, da bi nekdo pisal teoretični del izpita komaj zadostno, kolokvijski del pa slabo, tako da bi tudi po ustnem delu kolokvija seštevek po formuli ne dosegel meje za pozitivno oceno. Zato bo s študijskim letom 2012/13 vpeljana dodatna varovalka, da na ustni del kolokvija pride samo tisti študent, ki na pisnem delu kolokvija doseže najmanj 40-odstotni uspeh.

Primeri sestavljanja ocene:

Prvi primer: Seminar 8, poročila z vaj 9, vprašanja z vaj 7, teorija 57 %. Ocena se sestavi takole: 8*0,5 + 9*1 + 7*3,5 + 57*0,5 = 4 + 9 + 24,5 + 28,5 = 66, kar pomeni končno oceno 7.

Drugi primer (zelo dober študent): Seminar 9, poročila 10, vprašanja z vaj 9, teorija 89 %: seštevek točk je 4,5 + 10 + 31,1 + 44,5 = 90,1, ocena 10.

Tretji primer (manj uspešen študent): Seminar 6, poročila 7, vaje 4, teorija 50 %: seštevek točk je 3 + 7 + 14 + 25 = 49, ocena 6.

Popravljanje ocene:

Popravljanje ocene je možno samo s ponovnim pisanjem izpita in hkrati kolokvija. Velja boljša ocena. Za popravljanje se prijavite v referatu ali po e-pošti (v obeh primerih na izpit prinesite natisnjeno prijavnico).

Če niste zadovoljni z oceno na pisnem delu izpita/kolokvija, vam ni treba priti na ustni del kolokvija. Lahko mi sporočite, da boste prišli popravljati oceno in v VIS vam bom vpisal oceno 5. Vendar v tem primeru tvegate, da morda tudi na naslednjem roku izpita ne opravite. Zato je bolj varno, da opravite tudi ustni del kolokvija in s tem zaključite rok.

V primeru, da zavlačujete z ustnim delom kolokvija tako dolgo, da medtem že popravljate oceno na naslednjem pisnem roku, vam bom za predhodni rok v VIS vpisal oceno 5 in naslednji rok štel za novo opravljanje izpita.

Literatura

Twyman & Primrose: Principles of Gene Manipulation and Genomics. Oxford: Blackwell Publishing, 2006.