Nukleosomi med replikacijo

Uvod

Kromatin je kompleks DNA in proteinov. Osnovne strukturne enote kromosoma so nukleosomi. Ti so sestavljeni iz histonskega oktamernega kompleksa, okoli katerega naredi DNA 1,6 obrata, dolgega približno 147 baznih parov.(Li, Burgess, & Zhang, 2012) Osnovna naloga histonov v nukleosomih je zgoščevanje DNA verige v kompaktno strukturo ter omogočanje organizacije DNA v evkromatin in heterokromatin. To je v večini primerov doseženo z metilacijo in acetilacijo histonov, predvsem na lizinskih ostankih. (Whitehouse & Smith, 2013)

Vendar kromatin in z njim nukleosomi niso le stacionarna struktura. Pred vsako celično delitvijo mora celica skozi proces replikacije celotnega genoma, pri čemer nukleosomi predstavljajo oviro za replikacijske vilice. Hkrati imajo histoni pomembno strukturno in funkcionalno vlogo, zato za uspešno replikacijo dednega materiala ni pomembna le natančna podvojitev nukleotidnega zaporedja materinske verige, temveč tudi, da se na obe hčerinski verigi prenesejo informacije, ki jih nosijo histoni.

Raziskovanje dinamike nukleosomov med replikacijo je pokazalo, da se starševski nukleosomi po predhodni disociaciji prerazporedijo po hčerinskih verigah, preostalo pa zapolnijo histoni sintetizirani de novo. Pri tem imajo pomembno vlogo dve skupini proteinov. Prvi so histonski šaperoni, ki omogočajo urejeno izgrajevanje nukleosomov, saj ob vezavi na histone nevtralizirajo njihov naboj in preprečijo nespecifične interakcije z DNA (Mello & Almouzni, 2001). V drugo skupino pa sodijo kromatin preoblikovalni kompleksi, ki s pomočjo hidrolize ATP pretrgajo vezi med histoni in DNA med razgradnjo kromatina ter jih ponovno tvorijo med izgradnjo. (Ransom, Dennehey, & Tyler, 2010)

Razpad nukleosomov

Proteini replisoma so v tesni interakciji z verigo DNA, zato se zdi smiselno, da morajo histoni pred replikacijskimi vilicami popolnoma oddisociirati iz DNA. Raziskave so pokazale, da je 300 bp pred replikacijskami vilicami golih, torej brez vezanih histonov.(Ransom et al., 2010)

Disociacija histonov z DNA poteka v dveh delih. V prvem z nukleosoma disociirata kompleksa H2A-H2B, kar v nasledjem koraku omogoči disociacijo bolj stabilnega (H3-H4)2 tetramera. Predlagana sta dva mehanizma disociacije dimerov H2A-H2B iz nukleosoma. Po prvem na bi se na nukleosom vezal histonski šaperon FACT (facilitates chromatin transcription), ki naj bi omogočil disociacijo dimera. FACT se povezuje tudi s proteini replisoma, predvsem s helikazo MCM in DNA polimerazo 1. Po drugi poti naj bi v disociaciji sodeloval histonski šaperon Nap1, ki naj bi se vezal zgolj na dimera in jih v povezavi z ATP-aznim faktorjem RSC (chromatin structure remodeling complex) ločil iz nukleosoma. (Ransom et al., 2010)Po odcepu dimerov H2A-H2B se iz DNA odcepi še tetramer (H3-H4)2. V tem procesu naj bi sodeloval šaperon Asf1 (anti-silencing factor-1), ki bi tetramere v celoti odcepil.

Bolje raziskana tema je dogajanje, povezano s histoni po njihovi disociaciji iz starševske verige. Ob opazovanju le starih histonov se je izkazalo, da se že obstoječi histoni in s tem modifikacije, ki jih nosijo, razporedijo naključno med obe hčerinski verigi. Po disociaciji dimerov H2A-H2B so (H3-H4)2 tetrameri še vedno stabilni in se prenašajo na novonastali vijačnici brez da bi razpadli.(Annunziato, 2005) Tako naj bi se med replikacijo na novo nastajajoči verigi najprej vezali tetrameri [H3-H4]2, šele kasneje pa dimeri H2A-H2B.(Ransom et al., 2010)

Tak mehanizem bi omogočil tudi prenos epigenetske informacije. Obstoječe modifikacije na starševskih histonih vežejo preoblikovalne komplekse, ki modificirajo bližnje de novo sintetizirane kromosome. (Whitehouse & Smith, 2013)

Sestavljanje novih histonov

Takoj po sintezi se histoni postranslacijsko modificirajo. Med temi modifikacijami so večinoma acetilacije, metilacije so redke. Modifikacije bi lahko pomagale bodisi pri interakcijah s histonskimi šaperoni, bodisi pri prenosu histonov v jedro.(Li, Burgess, & Zhang, 2012)

Najbolj konservativna oznaka je diacetilacija histona H4 na lizinih na mestih 5 in 12. Ta modifikacija se zgodi preden histon interagira s histonskim šaperonom Asf1 v citoplazmi in je katalizirana s Hat1 acetiltransferaznim kompleksom. Funkcija diacetilacije histona H4 še ni popolnoma znana. Obstaja možnost, da regulira funkcijo CAF-1 (chromatin assembly factor-1) pri sestavljanju nukleosomov in omogoča lažji prenos H3-H4 kompleksa v jedro. (Li et al., 2012)

Acetilacije histonov H3 se med vrstami sicer ohranjajo, vendar so mesta teh modifikacij drugačna. Nekateri organizmi, kot so S. cerevisae in kvasovke, imajo acetiliran lizin na mestu 56. To modifikacijo katalizira Rtt109-Vps75 kompleks, ki za substrat uporabi Asf1-H3-H4. Za acetilacijo je potreben samo Rtt109, Vps75 pa slednjega stabilizira in je pomemben za njegov prenos v jedro. Modifikacija lizina na mestu 56 igra pomembno vlogo pri sestavljanju nukleosomov, saj se histoni s to modifikacijo v zgodnji S fazi celičnega cikla, ko je njihova koncentracija najvišja, vežejo le na replicirajočo DNA. Druga funkcija te modifikacije je tudi povečanje afinitete H3-H4 kompleksa do CAF-1 in Rtt106. Histon H3 se lahko modificira tudi na N-terminalnem koncu, kar pa vpliva samo na interakcijo med CAF-1 in H3-H4 kompleksom. Mesto slednje modifikacije se med organizmi razlikuje.(Li et al., 2012)

Prvi šaperon, ki se veže na H3-H4 kompleks je Asf1 , ki je vpleten v acetilacijo histonov ter njihov prenos v jedro. Asf1 je pomemben tudi pri razstavljanju histonov na materinski verigi. Pri sesalcih sta prisotna dva homologa (Asf1a in Asf1b), ki se vežeta tudi na helikazo, zato sta zelo pomembna pri napredovanju replikacijskih vilic. (Li et al., 2012)

Pomemben šaperon pri izgradnji nukleosoma je CAF-1, ki se veže na novonastali histonski kompleks H3-H4. Ali ima kakšno funkcijo pri prenašanju histonov iz materinske verige na hčerinski še ni znano.(Li et al., 2012) Sestavljen je iz treh domen (p150, p60 in p50). Histoni se vežejo na p150 podenoto.(Krude, 1995) CAF-1 interagira s PCNA (proliferating cell nuclear antigen). To je homotrimerni obroč okoli hčerinskih verig DNA, na katerega se lahko veže p150 podenota CAF-1.(Mello & Almouzni, 2001) Ta interakcija je med vrstami zelo konservativna. Podobno funkcijo kot CAF-1 ima tudi Rtt106, vendar delovanje slednjega v primerjavi s CAF-1 še ni dobro znano. Možno je, da odlaga histone samo na eni od sestrskih verig, lahko pa samo na določenih zaporedjih. Prav tako ni še znano, kako Rtt106 interagira z replikacijskimi vilicami.(Li et al., 2012)

Izgradnja nukleosomov

Postopek izgradnje nukleosomov pri replikaciji DNA je podoben njihovemu razpadu. V prvi stopnji se na vijačnico DNA veže tetramer (H3-H4)2 , temu pa nato sledi še dogradnja z dimeri H2A-H2B.(Annunziato, 2005)

Ker se (H3-H4)2 tetrameri pridobijo iz dveh različnih izvorov - starševske dsDNA in de novo histoni, poteka vezava tetramerov prek dveh različnih poti.(Akey & Luger, 2003) Tetramer s starševske DNA se veže na protein Asf1, čeprav nekateri poskusi nakazujejo, da naj bi se v vmesnem nevezanem času tetramer razdelil na dva z Asf1 vezana dimera, ki naj bi se vezala na DNA s pomočjo MCM-Asf1- (H3-H4)2 kompleksa kot tetramer. Temu naj bi sledila vezava dimerov H2A-H2B s pomočjo šaperonov FACT ali pa Nap1.(Annunziato, 2005)

Vezava novonastalih histonov naj bi potekala s pomočjo CAF-1. Na tem šaperonu naj bi se najprej tvoril tetramer, ki se nato veže na DNA. Dogradnja nukleosomov poteče na enak način kot pri prej opisanih starševskih histonih.(Annunziato, 2005)