Popravljanje z izcepom nukleotida
Popravljanje z izrezom nukleotida (ang. Nucleotide excision repair oz. NER) je večstopenjski popravljalni mehanizem DNA, ki prepozna in odstrani širok nabor raznoterih poškodb na DNA, ki destabilizirajo dsDNA. V osnovi delimo proces na GG-NER (global genome NER), ki je odgovoren za iskanje ter odpravljanje poškodb po celotnem genomu, ter TC-NER (transcription-coupled NER), ki je sklopljen s transkripcijo in se tako izvede ob zaznavi poškodbe med samo transkripcijo. Sosledje dogodkov, ki sestavljajo NER, vključuje:
- zaznavo poškodbe in njeno potrditev;
- cepitev dveh fosfodiesterskih vezi (na 5' ter 3' koncu) poškodovane verige;
- izrez nastalega fragmenta, ki vsebuje poškodovani del;
- sintezo nove ssDNA (komplementarne glede na nepoškodovano matrično verigo) na mestu poškodbe;
- lepljenje koncev novonastalega oligonukleotida.
Poškodbe DNA
NER je edinstven popravljalni mehanizem zaradi sposobnosti poprave poškodb, ki so lahko posledica zelo različnih fizikalno-kemijskih dejavnikov. Ti vključujejo: UV-radiacijske poškodbe DNA, med katerimi sta najpomembnejša ciklobutanski pirimidinski dimeri (CPD) ter fotoprodukt (6-4) (6-4PP), adukte s številnimi kemičnimi sredstvi (cisplatin, psoralen, alfatoksini, benzo[a]piren, drugi policiklični karcinogeni,…), z oksidativnim stresom povezane poškodbe (npr. tvorba ciklopurinov) ter nekatere poškodbe, ki so posledica ionizirajočih sevanj.NER predstavlja pri višjih sesalcih (vključujoč človeka) edini mehanizem, ki je zmožen popraviti UV-radiacijske poškodbe (CPD, 6-4PP,…)!
Da lahko NER v začetni fazi učinkovito zazna vse te različne poškodbe, se je sistem uravnal na skupno lastnost, ki združuje vse poškodbe, ki so posledica delovanja zgoraj naštetih sredstev. Vse poškodbe namreč povzročijo motnjo v povezovanju komplementarnih verig DNA oz. destabilizacijo Watson-Crickovih baznih parov, kar povzroča strukturno spremembo DNA na mestu poškodbe in njeni bližnji okolici. Zaradi oslabljenega povezovanja s komplementarno verigo postanejo baze bolj "ohlapne" (tako okvarjene, predvsem pa "zdrave" na komplementarni verigi!) in tako bolj izpostavljene in dostopne za vezavo na proteine, ki ta destabilizirana območja iščejo.
Zaznava in proces iskanja poškodbe je ključen korak pri vseh procesih popravljanja DNA. Pri GG-NER pa ta korak zahteva še posebej dodelan mehanizem, ki je strukturno nespecifičen in išče zgolj mesta v DNA, kjer je prišlo do destabilizacije in tako posredno zazna poškodbo.
Glavni faktor zaznave poškodbe pri evkariontih je XPC protein (Xeroderma pigmentosium C), ki v svoji funkciji iskanja poškodbe nastopi še z dvema pomožnima faktorjema: RAD23B ter centrin 2 (CENT2).
Strukturne študije so razkrile, da se XPC na mesto poškodbe veže na komplementarno, nepoškodovano verigo, kar mu omogoča zaznavo raznoterih poškodb.
Raziskave so pokazale, da in vitro XPC res svojo funkcijo sam dobro opravlja, v in vivo sistemih pa včasih potrebuje dodatne faktorje, ki pomagajo pri zaznavi določenih poškodb. Ena izmed najpomembnejših takšnih poškodb je ravno CPD, ki je tudi najpogostejša UV-radiacijiska poškodba.
Za popravo CPD mora tako poškodbo samo pred vezavo XPC zaznati UV-DDB kompleks (ultraviolet radiation-DNA damage-binding protein). UV-DDB je heterodimer, ki ga sestavljata DDB1 ter DDB2, in ima izrazito veliko afiniteto za vezavo CPD ter 6-4PP. Vezava UV-DDB sproži in vivo akumulacijo XPC na mesto poškodbe (CPD, v manjši meri tudi 6-4PP). Izkazalo se je tudi, da ima UV-DBB pomembno vlogo pri uravnavanju procesa na nivoju kromatina, saj je UV-DBB tudi del ubikvitin ligaznega kompleksa E3 (UV-DDB-CUL4-ROC1), ki ob asociaciji UV-DDB na poškodbo ubikvitinira histone, na katere je navita poškodovana DNA. DNA se tako sprosti s histona (oz. nukleosoma) in postane dostopna za prvi korak NER-vezava XPC ob mestu poškodbe.
Po uspešni vezavi XPC na DNA lahko potečejo nadaljnji koraki NER, katerih gonilo so protein-protein interakcije med NER faktorji na mestu vezave XPC.
Sprožitev procesa TC-NER poteka neposredno ob transkripciji, signal za poškodovano DNA pa predstavlja kar ustavitev RNA Pol II, ki ne zmore čez poškodbo na prepisujoči se verigi.
Popravljanje z izcepom nukleotida ob transkripciji (TC-NER)
Napake zaradi CPD so manj izrazite, zato se lahko izognejo GG-NER, kljub temu pa onemogočajo replikacijo in transkripcijo. Ko RNA polimeraza II dospe do poškodovanega nukleotida, se zaustavi. Nanjo se vežeta proteina Cockaynovega sindroma CSB in CSA. CSB preoblikuje kromatin v bolj odprto obliko s primerno konformacijo za popravilo. Taka RNA polimeraza II z dodatnimi proteini pokriva območje okrog 35 nukleotidov in s tem zakriva poškodovani nukleotid. Običajno se kompleks premakne nazaj in tako razkrije poškodovano mesto, kjer poteče izrezovanje.
Sklopitev GG-NER in TC-NER
Vezan XPC oz. CSB omogoča asociacijo kompleksa TFIIH (transkripcijski iniciacijski faktor IIH). Podenoti kompleksa sta helikazi XPB in XPD, ki se vežeta na DNA tik ob poškodovanem nukleotidu, verigo odvijeta ter še bolj razpreta. XPD služi tudi kot sekundarna potrditev lezije, saj vsebuje kanal, skozi katerega lahko teče le nepoškodovana ssDNA, ko pa naleti na poškodbo, se tik ob njej zaustavi. Če XPD poškodbe ne najde, celoten kompleks za popravljanje z izcepom nukleotida razpade in popravljanje se prekliče.
Na poškodovan nukleotid se z motivom cinkovega prsta na 5' veže XPA, ki prav tako služi potrditvi spremembe nukleotida, poleg tega pa sodeluje kot osrednji povezovalni člen in organizator kompleksa popravljanja.
Sedaj nepoškodovano ssDNA prepozna in se nanjo veže več molekul RPA (replikacijski protein A). Sledi ireverzibilna stopnja izcepa nukleotidov, ki se mora izvršiti do konca, da ne bi prišlo do še hujših modifikacij DNA. RPA v sodelovanju z XPA uravnava vezavo endonukleaze XPF-ERCC1 na mesto 5' ssDNA, na mesto 3' pa endonukleazo XPG. Najprej se prekine veriga na 5' koncu, kjer se lahko takoj začne sinteza ustreznega komplementarnega dela, nato pa se prekine še del na 3' koncu; skupaj (nesimetrično glede na poškodbo) 22-30 nukleotidov dolg odsek ssDNA, ki prosto oddisociira z mesta poškodbe.
Ustrezna DNA polimeraza zapolni nastalo vrzel; kot začetni nukleotid uporabi kar 3' konec stare verige, zadnjo vez na novem 5' koncu pa vzpostavi še DNA ligaza. Po ustreznem popravilu se na ta odsek vežejo novi histoni, okrog katerih se ovije popravljena dsDNA.
Vpliv na celični cikel
Celični cikel mora biti uravnan tako, da ne pride do replikacije med popravljanjem poškodb. ATR (z ATM povezan protein) se aktivira zaradi povezave z RPA, ki asociira z ssDNA. Aktiviran ATR sproži kaskado, ki ustavi celico v fazi G1 ali G2. S tem NER pridobi več časa za dokončanje popravila. Če so poškodbe preobširne, p53 sproži apoptozo. V primeru, ko RNA polimeraza zaobide poškodbo, pride do nepravilnega prevajanja in mutageneze.
Popravljanje z izcepom nukleotida v prokariontih
Prokariontski sistem temelji na zgolj štirih encimih. Kompleks UvrA2B ima helikazno aktivnost in išče morebitne poškodbe. Ko naleti na spremembo konformacije, nanj asociira UvrC. Podenota UvrC je sposobna izcepa oligonukleotida, na katerega prost 3' konec se veže UvrD in ga odstrani. Vrzel se nato zapolni.
Če pride ob transkripciji do zastanka RNA polimeraze, se nanjo veže TRCF (povezovalni faktor popravljanja med transkripcijo) in polimerazo pomakne nekoliko proč od mesta poškodbe, nato pa pritegne UvrA2, ki asociira z UvrB; prokariotnska procesa sta tako podobno sklopljena kot evkariontska.
Okvare mehanizma popravljanja z izcepom nukleotida in klinične posledice
Viri
- Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. J. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nature Reviews: Molecular Cell Biology, vol. 15, 2016, str. 465-481.
- Costa, R. M. A., Chiganças, V., Galhardo, R. S., Carvalho, H., Menck, C. F. M. The eukaryotic nucleotide excision repair pathway. Biochimie, vol. 85, 2003, str. 1083–1099.
- Truglio, J. J., Croteau, D. L., Houten, B. V., Caroline Kisker, C. Prokaryotic Nucleotide Excision Repair: The UvrABC System. Chemical Reviews, vol. 106, št. 2, 2006, str. 233-252.
- Aziz S., Reardon JT. Nucleotide Excision Repair. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 79, 2005, str. 183–235.