Quantifly
Uvod
V zadnjih letih se ljudje čedalje bolj zavedamo problematike onesnaženosti okolja na različnih nivojih. V zraku so na primer prisotni številni plini in trdni delci s škodljivim vplivom na zdravje ljudi in na okolje, ki nastajajo pri nekaterih naravnih pojavih kot so vulkanski izbruhi, požari in razgradnja organskih snovi, ter predvsem kot posledica človeške dejavnosti (npr. industrija, promet, kmetijstvo in ogrevanje). Hlapne organske spojine, med katere spadajo nekateri ciklični aromatski ogljikovodiki in aldehidi, sicer predstavljajo le 2 % snovi, ki prispevajo k onesnaženosti zraka, njihov škodljiv vpliv na zdravje ljudi in na okolje pa je zelo velik. Skupina študentov iz Pariza je v svojem projektu, s katerim je sodelovala na sinteznobiološkem tekmovanju iGEM 2016, izdelala mobilno napravo za zaznavanje in natančno kvantifikacijo omenjenih organskih onesnaževalcev zraka, ki so jo poimenovali Quantifly.
Oblikovanje biosenzorja
Biosenzorji so celostne in samostojne merilne naprave oz. sistemi, ki vsebujejo biološko komponento, sposobno prepoznavanja in kvantifikacije specifičnih dražljajev. Lahko gre za makromolekulo, organel, celico ali tkivo. Ključna elementa biosenzorja sta detektor, ki prepozna vhodni dražljaj in reporter, ki sproži izhodni signal.
Mladi francoski sintezni biologi so izdelali celični, natančneje bakterijski biosenzor. Kot ogrodje so uporabili nepatogeni laboratorijski sev bakterijske vrste Escherichia coli, DH5α. S ciljem ustvariti organizem, ki bo zaznal specifičen onesnaževalec zraka in se nanj odzval z oddajanjem bioluminiscenčnega signala, so izdelali genski konstrukt, sestavljen iz konstitutivnega promotorja Pr, gena XylR, inducibilnega promotorja Pu, gena GLuc in plazmidnega ogrodja pSB1C3.
Konstitutivni promotor Pr uravnava izražanje gena za protein XylR. Ta detektorski protein je sposoben vezave aromatskih ogljikovodikov z metilno skupino (npr. toluen in ksilen). Ko veže tako molekulo, se konformacijsko spremeni, dimerizira in se veže na DNA, ob dimerizaciji dveh dimerov pa kot transkripcijski regulator deluje na promotor Pu. Aktivacija promotorja Pu omogoči transkripcijo gena GLuc, ki kodira za reporterski bioluminiscenčni protein luciferazo iz organizmov rodu Gaussia. Ta encim katalizira oksidacijo organske spojine koelenterazin, pri čemer se sprošča modra svetloba z emisijskim maksimumom pri 488 nm.
Optimizacija plazmida
Da bi dosegli čim boljše delovanje zgoraj opisanega genskega konstrukta, so člani pariške sinteznobiološke ekipe uporabili pred kratkim ustvarjeno prosto dostopno programsko opremo CelloCAD. Deluje tako, da genski konstrukt, ki ga vnesemo v program, s pomočjo zmogljivih bioinformatskih orodij preoblikuje v najboljši možen plazmid za izbrano kombinacijo genetskih elementov. Študentje so želeli primerjati delovanje samostojno zasnovanega plazmida s plazmidom, ki ga oblikuje program (npr. območje detekcije in odzivnost). Pri tem so naleteli na oviro, saj je za delovanje programske opreme potrebno vnesti relativne enote promotorjev (ang. relative promoter units, RPU). Na voljo namreč (še) ni nobene podatkovne baze RPU za to razmeroma novo metodo. Tako so nadobudni študentje z upanjem, da bo njihovo delo predstavljalo začetek množičnega zbiranja podatkov o RPU, določili RPU za promotorja Pr in Pu. V ta namen so oblikovali serijo biokock, pri čemer so izbrana promotorja povezali z zapisom za zeleni fluorescirajoči protein (ang. green fluorescent protein, GFP). RPU so neposredno povezane z izražanjem GFP v posamezni celici, kar so kvantificirali s pretočnim citometrom.
Strojna oprema
Dron
Epruveta za bakterije
Zaključek
Ob zaključku projekta študentje predlagajo nekaj izboljšav, ki bi lahko doprinesle h kvaliteti njihovega prototipa. Standardno krivuljo nameravajo izboljšati z meritvami nižjih koncentracij toluena ter določiti najnižjo koncentracijo, ki jo Quantifly natančno zazna. Izvesti nameravajo še eksperimente z ostalimi toluenu podobnimi molekulami kot je npr. ksilen. Iz praktičnih razlogov so v laboratoriju bioluminiscenčne teste izvajali s tekočim toluenom, v prihodnje pa želijo vzpostaviti izolirano hermetično zaprto sobo s hlapi toluena, v kateri bi lahko opravili vzorčenje zraka. Veliko težavo, katere rešitve študentje zaenkrat ne komentirajo, pa predstavljajo variacijev bioluminiscenčnem testu, ki so posledica razlik v metabolizmu živih organizmov. Kljub pomanjkljivostim projekta je bila ekipa v sklopu tekmovanja iGEM 2016 za svoje delo nominirana za najboljši okoljski projekt, najboljšo predstavitev projekta in najbolj uporaben projekt.
