Bioinženiring rastlinske kulture Capsium frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina
Ekstrakt vanilije (Vanilla plantifolia ali Vanilla tahitensi) je zelo pogosto uporabljen v prehrambeni industriji in industriji pijač ter rudi v parfumeriji in farmacevtskih produktih. Sestavljen je iz več kot 200 različnih komponent, od katerih je najpomembnejši vanilin. Pridobivanje ekstrakta iz rastlin vanilije je zahtevno, zato se večina vanilina pridobi s kemijskimi pretvorbami koniferina, gvajakola, evgenola in lignina, vse več pa je zanimanja za biotehnološko proizvodnjo vanilina v tkivnih kulturah vanilije ali v gensko spremenjenih rastlinah in mikroorganizmih.
Proizvodnja vanilina v čiliju
V vaniliji encim vanilin sintaza (gen VpVAN) pretvori ferulinsko kislino (in njen glikozid) v vanilin (in njegov glikozid). Ferulinska kislina in vanilin pa sta tudi prekurzorja biosintezne poti kapsaicina v čiliju (Capsicum frutescens). Zato so se Yang Chee in sodelavci odločili pripraviti transgenske rastline čilija z genom za vanilin sintazo, ki bi služile kot osnova za nadaljnji razvoj transgenskih rastlin v proizvodnji vanilina.
Priprava transgenskih rastlin čilija
Pripravili so sintezno nukleotidno zaporedje s promotorjem CaMV 35 S in genom za vanilin sintazo iz Vanilla plantifolia (VpVAN), ki so ga modificirli tako, da so upoštevali rabo kodona v rastliniNicotania benthamiana. Sintezno zaporedje so vstavili v vektorsko ogrodje z zapisi za odpornost na kanamicin, ampicilin in blasticidin. Plazmid so transformirali v bakterije in jih gojili v mediju z ampicilinom in kanamicinom. Iz bakterij izoliran plazmid so nanesli na zlate delce velikosti 1,6 μm in jih uporabili za mikrobombardiranje rastlinskih kultur, ki so jih pripravili iz kalečih semen. Po prekonočni inkubaciji v temi so kulture prenesli v medij, ki je vseboval blasticidin.
Določitev vsebnosti vanilina v transgenskem čiliju
Za določitev prisotnosti ustreznih metabolitov so iz uspešno transformiranih kalusov ekstrahirali fenolne spojine in ekstrakt analizirali s HPLC. Želene spojine v eluatu so določili z merjenjem absorbance: vanilin pri 280 nm, vanilinsko kislino pri 260 nm, vanilin-beta-D-glukozid pri 270 nm in ferulinsko kislino pri 280 nm. Primerjali so količine vanilina v netransformiranih in transformiranih kalusih in ugotovili, da netransformirani kalusi vsebujejo 3,32 ± 0,83 μg vanilina na g tkiva, transformirani pa 573,39 ± 120,70 μg na g tkiv, kar je približno 190-kratna razlika. Stroki vanilije vsebujejo 20 mg vanilina na g suhe teže.
Možnosti izboljšanja proizvodnje vanilina v C.frutescens
Sintezo vanilina bi bil možno izboljšati z zmanjšanjem pretvobe vanilina v kapsaicin ali s povečanjem aktivnosti encimov, ki sodelujejo v sintezi vanilina. Nekaj raziskav, ki kažejo na možnosti regulacije sintezne poti, so že opravili. Tako je na primer supresija izražanja domnevnega gena za aminotransferazo v C. frutescens, ki v biosintezni poti kapsaicina katalizira pretvorbo vanilina v vanilamin, ustavila proizvodnjo vanilamina, kar je znižalo količine kapsaicina in zvišalo količine vanilina in vanilinske kisline. Poleg tega so raziskovalci tudi že dokazali, da dodatek 200 μM salicilne kisline v celične kulture Capsicum chinese poveča aktivnost fenilalanin amoniak-liaze, ki je ključen enim v sintezi cimetne kisline, prekurzorja ferulinske kisline (in vanilina).
Raziskovalci so opazili tudi, da se količina ferulinske kisline ne razlikuje bistveno med transformiranimi (1,12 ± 0,32 μg/g) in netransformiranimi (1,53 ± 0,01 μg/g) rastlinami. Iz tega so sklepali, da se poraba ferulinske kisline zaradi sinteze vanilina kompenzira z zmanjšano sintezo lignina, saj je ferulinska kislina tudi intermediat sinteze lignina. Zato bi lahko tudi modifikacije v sintezni poti lignina vplivale na povečanje sinteze vanilina. Študije na transgenskem tobaku so pokazale, da zmanjšanje izražanje encima cinamilalkohol dehidrogenaze (encim, ki sodeluje pri sintezi lignina) za do desetkrat poveča vsebnost vanilina v rastlini. Podobni so tudi rezultati raziskav na transgenskih topolih, kjer je zmanjšanje izražanje encima cinamoil-CoA reduktaze (prav tako encim, ki sodeluje pri sintezi lignina), povzročilo povečanje količine ferulinske kisline.
Zaključek
Avtorji so uspešno pripravili transgenske rastline čilija, ki proizvedejo skoraj 200 X več vanilina, kot ga nastaja v divjem tipu rastline. Njihova raziskava predstavlja osnovo za nadaljnji razvoj transgenskih rastlin za proizvodnjo vanilina. Hkrati so nakazali nekaj možnosti za nadaljnje izboljašave sinteze vanilina v rastlinah.
