FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich.

Spletna stran projekta FlavoFlow, iGEM 2020 [1]: https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania

Opis problematike

Ribogojnice s 'krožnim' delovanjem (angl. Recirculating Aquaculture System - RAS) so skoraj povsem zaprt sistem, kjer se voda iz bazenov z ribami prečisti (z mehanskimi in biološkimi filtri), obogati s kisikom (in dodatno vodo, ki je iz sistem izhlapela) in ponovno uporabi [2]. Takšni sistemi so dobra rešitev za pridobivanje rib, saj z rastočo populacijo ljudi narašča tudi potreba po morski hrani. Problem sistemov RAS pa so lahko okužbe (virusne, bakterijske, glivne). [1] Pogoste patogene bakterije rib so Flavobacterium columnare, Flavobacterium psychrophilum in Flavobacterium branchiophilum. Povzročajo bakterijsko bolezen hladnih voda (angl. bacterial cold water disease) ali sindrom mavrične postrvi (angl. rainbow trout fry syndrome), bolezen columnaris in bakterijsko bolezen škrg (angl. bacterial gill disease). Tovrstne okužbe se odražajo v spremenjenem obnašanju in izgledu rib. Že 24-72 ur po pojavu teh sprememb smrtnost rib doseže 70%. Z obstojem sistema za detekcijo opisanih okužb, bi se ribogojniška podjetja izognila finančnim izgubam, ki so posledica propada velikih količin rib ob pojavu okužb.

Cilji projekta

Ekipa si je zastavila tri cilje.

1. Glavni cilj projekta Flavoflow je zasnova hitrega testa, s katerim bi lahko, ob sumu na okužbo, delavci v ribogojnicah hitro in enostavno identificirali bakterijsko vrsto, ki le-to povzroča, in pravočasno ukrepali. Želeli so zasnovati cenovno ugoden, robusten in prenosljiv senzor za detekcijo bakterij Flavobacterium columnare in Flavobacterium psychrophilum. Odločili so se za senzor, ki bo temeljil na metodi HLA (angl. isothermal helicase-dependent amplification) in LFA (angl. lateral flow assay).
2. Poleg detekcije bakterijske okužbe so želeli ustvariti tudi ustrezno rešitev za zdravljenje okuženih rib, pri čemer bi bila poraba antibiotikov čim manjša (zaradi globalnega problema prevelike uporabe antibiotikov in antibiotične rezistence). Razvili so dva sintezno biološka sistema z uporabo AI-2 inducibilnih promotorjev. Zgoraj omenjene bakterije namreč na škrgah rib tvorijo biofilme (kar oteži privzem kisika in posledično propad ribe), ob tem pa izločajo molekule AI-2 (angl. autoinducer-2). Preko teh med seboj komunicirajo v t. i. procesu quorum sensing. Za zajezitev okužbe bi torej uporabili gensko spremenjene bakterije (s samomorilskim stikalom), ki bi ob prisotnosti molekul AI-2 sintetizirale molekule za uničenje bakterije, ki v ribogojnici povzroča okužbo.
3. Prav tako pa so želeli ustvariti tudi preventivno rešitev in tako preprečiti razvoj nadaljnjih okužb. Njihova ideja je bila pripraviti oralno cepivo, saj se večina cepiv ribam sicer dozira intraperitonealno, kar za ribe predstavlja dodaten stres. Odločili so se ustvariti cepivo proti F. columnare, pri čemer bi ribe imunizirali s proteinom GldJ, ki se nahaja na zunanji membrani te bakterije. Ker pa tudi virusi povzročajo obolenja rib, proti nekaterim pa še ni razvitih cepiv, so se odločili ustvariti cepivo proti virusu VHSV (angl. viral hemorrhagic septicemia virus), ki ima na svoji površini Glikoprptein G.

Podrobnejši opis

1. Detekcija okužbe

Z bioinformatsko analizo so najprej poiskali markerski gen, specifičen za za določeno bakterijsko vrsto. Uporabili so gen za 16S rRNA ter gen rpoC (specifičen za F. psychrophilum) in gen cslA (specifičen za F. columnare). Sledilo je dizajniranje treh ssDNA prob (detekcijske, lovilne in kontrolne) za test LFA in priprava začetnih oligonukleotidov za metodo HDA. Postopek hitrega testa: odvzem vzorca, liza celic (mehansko ali drugače), pomnožitev tarčnega gena patogene bakterije z metodo HDA, detekcija okužbe s testom LFA

• Metoda HDA je analogna metodi PCR, le da za samo izvedbo ni potrebna posebna laboratorijska oprema, saj reakcija poteka zgolj pri eni temperaturi, ki pa mora biti ves čas konstantna. V koliko je v vzorcu prisoten tarčni patogen, termostabilna DNA helikaza razvije dsDNA, nato proteini SSB (angl. single-stranded DNA-binding proteins) prekrijejo ssDNA, sledi vezava specifičnih oligonukleotidov (eden od teh se porabi, drugi pa je v presežku – asimetrična metoda HDA), DNA polimeraza nato podaljša DNA verigo in cikel se ponovi. Ker je torej den izmed oligonukleotidov v presežku (oz. drugega primanjkuje), dobimo po končani reakciji veliko ssDNA matric, ki jih potrebujemo za test LFA. Za izboljšavo in pocenitev metode HDA so uporabili helimerazo, ki omogoči tvorbo daljših fragmentov DNA, za izvedbo pa niso potrebni nekateri proteni SSB.

  Test LFA temelji na hibridizaciji nukleinskih kislin. Z njim so želeli vizualizirati pomnožke DAN, pridobljene z metodo HDA. Vzorec kanemo na testno ploščico in dodamo pufer. Tekočina se absorbira v membrano, ki vsebuje zlate nanodelce z dodanimi detekcijskimi sondami, kamor se vežejo ssDNA iz vzorca (prva hibridizacijska reakcija). Tako nastali kompleksi potujejo do nitorcelulozne membrane, kjer sta dve črti. Prva je t. i. testna črta, druga pa kontrolna. Na testni črti poteče druga hibridizacija, in sicer kompleks nanodelca z vezanimi ssDNA se veže na lovilno sondo. Ta je vezana na podlago, zato se nastali kompleksi kopičijo na testni črti, kar privede do rdeče črte, vidne s prostim očesom. Nanodelci brez vezanih ssDNA potujejo do kontrolne črte, kjer se hibridizirajo na kontrolno sondo, ki je prav tako pritrjena na podlagi. Ob pozitivnem testu torej zaznamo dve rdeči črti. Če je test negativen, je vidna zgolj kontrolna črta, v ostalih primerih (le testna črta ali nobena črta) pa je test neveljaven.

2. Zdravljenje okužbe

Oba sintezno biološka sistema temeljita na sintezi eksoliznov, razlikujeta pa se v načinu, kako celica (gensko spremenjena bakterija E. coli) lizira samo sebe. Uporabili so 3 različne inducibilne promotorje AI-2; nativnega (lsrACDBFG; K3416000) in dva mutirana (EP01r; K3416001 in EP14r; K3416014).

• Sistem endolizin/eksolizin: Celice E. coli (DH5alfa) zaznavajo eksogen AL-2 v okolju (ki jih izločajo npr. Flavobacterium), zaradi mutacije v genu luxS pa molekul AL-2 ne morejo proizvajati in so tako primerna šasija za zaznavanje in privzem molekul AL-2. Te v celice E. coli vstopijo skozi transporter IsrABC, nato pa se v citoplazmi fosforilirajo z LsrK. Fosforilirana molekula AL-2 (AL-2-P) se veže na represor LsrR, kar povzroči konformacijsko spremembo represorja, kompleks AL-2-P in represor pa se zato odcepi s promotorja. To povzroči transkripcijo 2 genov; gena za eksolizin in gena za endolizin. Eksolizin (protein virusa) je specifičen za posamezen bakterijski sev (ali seve) in torej, ko se sprosti iz E. coli, uniči bakterijo, ki povzroča okužbo. Do sprostitve eksolizina pa pride zaradi delovanja endolizina, ki lizira E. coli (in ima torej tudi vlogo samomorilnega stikala).
• Sistem toksin/antitoksin: Začetni del je enak; pri aktivaciji od AL-2 inducibilnega promotorja se prepiše gen za eksolizin. Hkrati pa pod šibkim konstitutivnim promotorjem poteka tudi transkripcija gena MazE, ki je antitoksin v sistemu MazEF. MazF je toksin (specifična endoribonukleaza; cepi mRNA za mestom ACA in prepreči sintezo proteina) in je tudi pod AL-2 inducibilnim promotorjem. Ko je količina MazF toksina nizka, ga MazE antitoksin inhibira (tvori heterokompleks), ko pa količina MazF naraste (preseže količino MazE), to pa s časoma povzroči lizo E. coli in sprostitev eksolizina iz E. coli' na mesto okužbe.

3. Preventiva

Ker bi cepivo vnašali oralno, bi imunogene proteine zapakirali v kroglice kalcijevega alginata (ki je biokompatibilen in odporen na nizek pH). Ta bi se v prebavnem traktu razgradil pod vplivom alginat liaze (algLs), ki jo izločajo nekateri mikroorganizmi v prebavilih rib. Imunogen protein bi se tako absorbiral v kri in prišlo bi do nastanka imunskega odgovora. Sintezo proteina gIdJ so načrtovali v bakterijskem ekspresijskem sistemu in gen klonirali v vektor pET28-a(+). Glikoprotein G pa so sintetizirali v kvasovki; gen so klonirali v vektor pfX-7.

Doprinos ekipe

• Karakterizacija biokock
  1. Zapis za protein mazE: BBa_K2142001 – mazE je antitoksin za toksin mazF
  2. zapis za protein mazF: BBa_K2142003 – mazF pa je antitoksin za mazE. Ta sistem toksin/antitoksin uporabljajo bakterije E. coli in druge za sprožitev programirane celične smrti kot odgovor na pomanjkanje hranil. Ko sta oba proteina izražena (koekspresija), ne vplivata na celično rast in viabilnost. Oba dela sta bila uporabljena 2016 s strani iGEM ekipe iz Gradca.
  3. Zapis za LuxS: BBa_K091109 - LuxS je sintaza, ki tvori 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD), ta pa spontano tvori signalno molekulo AI-2. Slednja je vpletena v mehanizem izražanja genov; v sistem guorum sensing (izražanje genov v odvisnosti od celične gostote). To biokocko je uporabila ekipa iGEM Davidson-Missouri Western, 2008.
• 3D model hitrega testa – pri razvoju senzorja jim je pomagalo podjetje Micromolds. Na voljo je 3D model, ki ga lahko natisne vsak imetnik 3D tiskalnika (npr. druge iGEM ekipe) in ga prilagodi svojim potrebam za LFA testiranje. Uporabi se lahko različne tipe plastike, tudi reciklirano plastiko. Zainteresirani pa lahko za model zaprosijo po e-pošti.

Viri

[1] https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania [2] https://www.aquacultureid.com/recirculating-aquaculture-system/