CyaSalt - metoda za razsoljevanje morskih voda

CyaSalt je projekt s katerim je sodelovala ekipa iz Linköpinga na tekmovanju iGEM 2021. Želeli so pripraviti metodo, ki temelji na sintezni biologiji, s katero je mogoče razsoliti morsko vodo z uporabo gensko spremenjenih fototrofnih organizmov.

Spletna stran projekta CyaSalt, iGEM 2021: https://2021.igem.org/Team:Linkoping_Sweden

Avtorica povzetka: Michelle Oletič

UVOD:

Pomanjkanje sladke vode je ena največjih globalnih težav, s katerimi se kot prebivalstvo soočamo. Danes samo kmetijstvo predstavlja skoraj 70 % porabe vode, kar predstavlja veliko obremenitev za vire sladke vode, ki so nam na voljo. Za obvladovanje te krize so se razvile in se še razvijajo metode za razsoljevanje morske vode. Vendar je vsem skupno to, da so energijsko zelo potratne in energija, ki se pri tem porablja ni obnovljiva [1].

IDEJA:

CyaSalt je metoda, ki izkorišča gensko spremenjene halofilne in fototrofne organizme za ustvarjanje sladke vode iz morske za potrebe kmetijstva. Organizmi, ki bi jih uporabljali so gensko modificirani tako, da izražajo proteine, ki bi se vezali na celično membrano in delovali kot ionske črpalke. Te črpalke bi imele poglavitno vlogo, saj bi v celico črpale natrijeve in kloridne ione [2]. Za gensko spremenjeni organizem so izbrali cianobakterije. Tako kot drugi fototrofni organizmi tudi cianobakterije izkoriščajo sončno svetlobo za fiksiranje ogljika, ki ga med drugim pretvorijo v kisik. Za projekt so izbrali Synechocystis sp. PCC 6803, ki je v genskem inženiringu pogosto uporabljeno cianobakterija . Sistem, sestavljen iz 4 delov, ki so jih želeli vnesti v fototrofni organizem, je bil zasnovan tako, da na koncu doseže razsoljevanje. 1 del pa je bil potreben za učinkovito ločevanje razsoljene vode od celic [8].

Deli, ki so potrebni za razsoljevanje:

Halorodopsin je kloridna črpalka, ki izvira iz arheje Natronomonas pharaonis. Aktivira jo svetloba in deluje tako, da olajša transport kloridnih ionov v notranjost celice, proti koncentracijskem gradientu. Kanal rodopsin je svetlobno induciran ionski kanal, ki izvira iz Chlamydomonas reinhardtii. Predhodno ustvarjen negativni membranski potencial, ki bi ga dosegli z uvedbo halorodopsina, nato pomaga kanal rodopsinu pri transportu natrijevih ionov v celice. Halorodopsin in kalan rodopsin za svoje delovanje potrebujeta all-trans retinal. Ta nastane pri cepitvi beta-karotena z beta-karoten 15,15'-dioksigenazo. Da bi dosegli vedno dostopen all-trans retinal, so v sistem vključiti tudi gen, ki kodira za beta-karoten 15,15'-dioksigenazo. Mehansko občutljiv ionski kanal z veliko prevodnostjo (MscL), ki je endogen v ciljnem organizmu, se aktivira z visokim osmotskim tlakom v celicah in preprečuje osmozo celic. Za namen ločitve razsoljene vode od celic je na membrano cianobakterij potrebno vnesti še fuzijski protein, ki bi omogočal enostavno afinitetno kromatografijo. Tak fuzijski protein bi sestavljala CBD-domena in protein S-plasti, imenovan slr1272. CBD-domena, je domena, ki veže ogljikove hidrate in izvira iz Clostridium thermocellum. Zamislili so si, da bi se CBD-domena vezala na celulozo, ki bi bila na filtru. Zato bi se organizmi, ki izražajo CBD na svoji površini, vezali na filter in se tam zadržali, medtem ko bi razsoljena voda stekla skozi. Da bi olajšali potrditev izražanja delov so zasnovali del z GFP. Z linkerjem (-GSGGGGGG-) je vezan na vsak rekombinanten protein in omogoča enostavno detekcijo izražanja rekombinantnih proteinov [2,3,5,7].

Končni cilj je, da lahko našo metodo razsoljevanja uporabimo v industrijskem obsegu. Razsoljevalni konstrukt bi bil sestavljen iz preproste namestitve, kjer bi do morske vode dostopali neposredno iz morja preko črpalke. Vodo bi zbirali v ločeni posodi, kjer bi bile modificirane cianobakterije za proces razsoljevanja. Fototrofe bi gojili na naravni sončni svetlobi in s hranili v morski vodi. Ko bi bila voda razsoljena bi se prefiltrirala preko filtra in vstopila v drugi rezervoar, kjer bi se razsoljena voda shranila in uporabljala v kmetijstvu.

IZVEDBA:

Matematični modeli:

Ena od pomanjkljivosti uporabe cianobakterij v raziskavah je njihova relativno počasna rast, s časom podvojitve 4-8 ur. Tudi zaradi tega bi raziskovanje vpliva različnih dejavnikov na rast cianobakterij v laboratoriju trajalo dolgo in potrebnih bi bilo veliko vzporednih eksperimentov. Da bi se temu izognili so zmodelirali matematične modele, ki omogočajo spreminjanje različnih parametrov še preden se lotiš dela v laboratoriju. Nameravali so narediti tri modele: model faze rasti, model faze razsoljevanja in model faze ločevanja. Vendar jim je uspelo zaradi pomanjkanja dejanskih eksperimentalnih podatkov izdelati le prvega. Model faze rasti je potreben, da se predvidi kombinacija vrednosti pH in slanosti. Model faze razsoljevanje bi lahko ocenil število bakterij, ki bi jih potrebovali za razsoljevanje 1 L morske vode. Model faze ločevanja pa bi potrebovali za povečanje učinkovitosti filtracije organizmov iz vode z uporabo CBD-domene. Potrebno je predvideti pri kakšnih pogojih bi bila vrednost Kd vezave liganda in CBD-domene najmanjša.

Gojenje Synechocystis sp. PCC 6803:

Za eksperimentalno preverjanje rasti v slani vodi so jih gojili v obalni vodi Gotlanda (Baltsko morje) in Göteborga (Severno morje), ki vsebujeta 1 % in 3 % soli, z dostopom do odprte atmosfere (to so dosegli z bombažnim čepom) in svetlobe. Sočasno so bili gojeni tudi v standardnem rastnem mediju BG-11 za Synechocystis sp. PCC 6803. Kot pričakovano so z največjo hitrostjo rasle cianobakterije v rastnem mediju BG-11. Rast v avtoklavirani morski vodi je kazala precej enakomerno krivuljo, čeprav z bistveno počasnejšo hitrostjo kot v BG-11, obenem pa so imele veliko nižjo optično gostoto. To je najverjetneje posledica pomanjkanja hranil. Posnemati so želeli tudi naravno okolje rasti Synechocystis sp. PCC 6803, zato so jih gojili v kulturah morskih voda. Pri tem so organizmi pokazali le rahlo rast, po 4 dneh pa so cianobakterije začele umirati, kar so vizualno opazili v erlenmajericah kot bledenje zelene barve kultur. Vzorce iz umirajočih kultur so še dodatno pregledali pod epifluorescenčnim mikroskopom, kjer so še potrdili, da so kulture umirale [8].

Da bi ugotovili vzrok umiranja cianobakterij so bila potrebna še nadaljna mikroskopska opazovanja. V vzorcih neavtoklavirane morske vode iz Gotlanda so našli potencialne plenilce, ki so najberjetneje amebe. Prejšnje študije so pokazale, da je potencialna rešitev za amebe, ki prežijo na cianobakterije, poslabšanje izražanja O-antigena v Synechocystis sp. PCC 6803, zaradi česar jih amebe ne prepoznajo. Druga rešitev je uporaba fototrofnega organizma, ki ni tarča plenilca. V vzorcih morskih voda so nekatere izmed opazovanih organizmov uspeli identificirani s primerjavo morfologije. Identificirane vrste so lahko Aphanizomenon, Nitzschia, Nostoc sp. ali Nodularia, Gloeocapsa in Woronichinia sp. Ker ti fototrofni organizmi kažejo boljšo rast v morski vodi v primerjavi s Synechocystis sp. PCC 6803, bi lahko bili bolj primerni za implementacijo sistema za razsoljevanje CyaSalt. Zlasti Aphanizomenon in Nodularia bi lahko delovala za razsoljevanje vode Baltskega morja, saj običajno cvetita v velikih količinah v Baltskem morju [4].

Izražanje halorodopsina:

BBa_K3892001 je bil kloniran v plazmid pUCIDT-Amp. Plazmid z vključenim insertom so transformirali v E. coli DH5α in v V. natriegens (sev Vmax). Kolonije, ki so zrasle so bile male in so rasle počasneje kot so predvidevali. Plazmide, ki so sprejeli vključek so poslali na sekvenciranje. Rezultati sekvenciranja pa so pokazali, da je bil gen, ki kodira za halorodopsin mutiran na mnogih pozicija v vseh produktih, kar je privedlo do tega da se je izražal skrajšan halorodopsin. To najverjetneje nakazuje na to, da je halorodopsin strupen za gostiteljski organizem in da zaporedje mutira zato, da bi gostiteljski organizem lahko preživel. Morebitne toksične učinke halorodopsina je treba raziskati in jih potrditi.

Problemi pri konstruktih:

Ekipa je imela zelo veliko težavo pri naročanju konstruktov. Načrt je bil, da se konstrukti, ki so jih zasnovali, sintetizirajo kot del plazmida, vendar na žalost podjetju za sintezo večine konstruktov ni uspelo izdelati. Zato so morali naročiti linearne konstrukte, kar pomeni, da so morali sami ligirati fragmente v plazmide. Ker so sami klonirali konstrukte v plazmid, so morali imeti delujoč sistem za izbiro kolonij z vključenim insertom. Zato so uporabili plazmid pUC19, ki se običajno uporablja za modro-beli test. Vsi neuspešni poskusi ligiranja pa so ekipo pripeljali do novega pristopa. Ugotovili so, da je ligiranje učinkovitejše z uporabo telečje intestinalne alkalne fosfataze (CIP). CIP katalizira defosforilacijo 5' in 3' koncev DNA. Defosforilacija preprečuje samo-ligacijo lineariziranega plazmida. Zato je manj možnosti, da se bo plazmid brez vključenega inserta ligiral sam vase.

ZBIRKA DELOV:

Vse dele so naročili kot sistem vključen v pUCIDT-Amp pri IDT. Vendar so bili njihovi poskusi sintetiziranja takega plazmida neuspešni. Ekipa pa je vseeno načrtovane dele podrobno dokumentirala. Osnovni deli, ki so jih oblikovali za projekt so:

• BBa_K3892000 (beta-karoten 15,15'-dioksigenaza)

• BBa_K3892001 (halorodopsin)

• BBa_K3892002 (distančnik-CBD)

• BBa_K3892003 (slr1272)

• BBa_K3892004 (MscL)

• BBa_K3892005 (distančnik-GFP)

• BBa_K3892006 (EforRed)

• BBa_K3892007 (kanal rodopsin)

• BBa_K3892008 (PpsbA2: nativni, močni konstitutivni promotor, pridobljen iz Synechocystis sp. PCC 6803)

• BBa_K3892009 (dstančnik-RBS-distančnik: vezno mesto ribosomov z distančniki)

• BBa_K3892010 (RBS G-10)

Oblikovali so tudi sestavljene dele, kjer so vsakemu od delov dodali še distančnik in zelen fluorescenčen protein (GFP). Tudi te sestavljene dele so podrobno dokumentirali.

ZAKLJUČEK:

Ekipa iz Linköpinga je na tekmovanju sodelovala z inovativno idejo, vendar so pri uresničevanju ideje naleteli na mnoge težave. Za udejanjenje te ideje bi bilo potrebno najverjetneje najti drug protein z podobno funkcijo in tudi organizem spremeniti tako, da ga plenilci v morskih vodah ne bi prepoznali.

VIRI:

[1] National Geographic. Freshwater Crisis. Citirano 15.5.2022. Dostopno na: https://www.nationalgeographic.com/environment/article/freshwater-crisis.

[2] Culligan E, Sleator R, Marchesi J, Hill C. Metagenomic identification of a novel salt tolerance gene from the human gut microbiome which encodes a membrane protein with homology to a brp/blh-family β-carotene 15,15'-monooxygenase. PLoS One. 2014 Jul 24;9(7):e103318.

[3] Bachin D, Nazarenko L, Mironov K, Pisareva T, Allakhverdiev S, Los D, 2015. Mechanosensitive ion channel MscL controls ionic fluxes during cold and heat stress in Synechocystis. FEMS Microbiology Letters, 362(12).

[4] Amezaga JM, Amtmann A, Biggs CA, Bond T, Gandy CJ, Honsbein A, Karunakaran E, Lawton L, Madsen MA, Minas K, Templeton MR. Biodesalination: a case study for applications of photosynthetic bacteria in water treatment. Plant Physiol. 2014 Apr;164(4):1661-76. doi: 10.1104/pp.113.233973.

[5] Zhang F, Vierock J, Yizhar O, Fenno LE, Tsunoda S, Kianianmomeni A, Prigge M, Berndt A, Cushman J, Polle J, Magnuson J, Hegemann P, Deisseroth K. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 2011 Dec 23;147(7):1446-57. doi: 10.1016/j.cell.2011.12.004.

[6] Zimmer M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chem Rev. 2002 Mar;102(3):759-81. doi: 10.1021/cr010142r.

[7] Tormo J, Lamed R, Chirino AJ, Morag E, Bayer EA, Shoham Y, Steitz TA. Crystal structure of a bacterial family-III cellulose-binding domain: a general mechanism for attachment to cellulose. EMBO J. 1996 Nov 1;15(21):5739-51.

[8] van Alphen P, Abedini Najafabadi H, Branco Dos Santos F, Hellingwerf KJ. Increasing the Photoautotrophic Growth Rate of Synechocystis sp. PCC 6803 by Identifying the Limitations of Its Cultivation. Biotechnol J. 2018 Aug;13(8):e1700764. doi: 10.1002/biot.201700764.