Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic

From Wiki FKKT
Jump to navigationJump to search

Povzeto po članku D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.


Uvod

Sposobnost manipulacije fizičnega položaja specifičnih celic je ključnega pomena za biomedicino, sintetično biologijo in področje živih materialov. To je mogoče doseči na različne načine, avtorji tega članka pa so se osredotočili na uporabo ultrazvoka. Slednji ima namreč sposobnost manipulacije s celicami z visoko prostorsko natančnostjo in hitro odzivnostjo preko akustične radiacijske sile. Ker pa ima večina celic podobne akustične lastnosti, so avtorji članka kot aktuatorje, tj. premikalnike celic, uporabili plinske vezikle. Z več eksperimenti so pokazali, da slednji omogočajo selektivno akustično manipulacijo celic, ki imajo v svoji citoplazmi prisotne plinske vezikle.

Sila akustičnega sevanja

Na majhen sferični delec v polju ultrazvočnega (UZ) stoječega valovanja deluje sila akustičnega sevanja (ang. acoustic radiation force, ARF). Slednja temelji na ustvarjeni tlačni sili, ki je časovno nespremenljiva in privlači telesa bodisi v območje najnižjega tlaka (na področje vozlišč/oslabitev valovanja), bodisi v območje najvišjega tlaka (na področje ojačitev valovanja). Ta sila je odvisna od razlik v gostoti in stisljivosti delca od okoliškega medija, kar je izraženo z akustičnim kontrastnim faktorjem Φ. Slednji določa smer delovanja ARF na delec v okoliškem mediju. Delci, katerih Φ > 0, se gibljejo v smeri območja oslabitve valovanja, delci, za katere je Φ < 0, pa potujejo v smeri ojačitev [1,2].

Preko ARF lahko z uporabo UZ enostavno manipuliramo z različnimi materiali, vendar pa je zaradi podobnih vrednosti Φ med različnimi celicami izziv povezati aktivacijo, ki temelji na ARF, z izražanjem specifičnega gena in posledično z manipulacijo specifičnih celic. Za to bi bilo potrebno genetsko kodirano sredstvo, ki bi lahko izrazito spremenilo akustične lastnosti celice. S tem v mislih so avtorji članka preverili, če lahko kot gensko selektivne aktuatorje uporabijo plinske vezikle [3].

Plinski vezikli se neposredno odzivajo na UZ

Plinski vezikli (ang. gas vesicles, GV) so votle proteinske nanostrukture, napolnjene s plini. Razvili so se v vodnih fotosintetskih mikrobih, kjer služijo kot sredstvo za doseganje plovnosti za boljši dostop do sončne svetlobe. Ker se GV bistveno razlikujejo v svojih fizikalnih lastnostih (nižja gostota in večja stisljivost) od okoliškega medija (voda), so raziskovalci domnevali, da bodo imeli izrazito drugačen Φ, zaradi česar bodo v polju UZ valovanja potovali drugače. GV so modelirali kot sferične delce z gostoto 120 kg/m3 in stisljivostjo 1,55 × 10^8 Pa^−1, ter tako ocenili akustični kontrastni faktor kot izrazito negativen (−11,7). Svojo domnevo so potrdili tudi z eksperimenti. GV so izolirali iz cianobakterije Anabaena flos-aquae (Ana) ter jih kemično označili s fluorescenčnim barvilom. Nato so raztopino GV prenesli v mikrofluidni kanal, opremljen s piezoelektričim resonatorjem, ki generira UZ valovanje z ustrezno valovno dolžino. Širina kanala je bila enaka polovični valovni dolžini generiranega UZ. Posledično so bila območja oslabitve v središču, območja ojačitve pa na steni kanala, kamor so tudi potovali GV. Kot kontrolo so uporabili počene GV, za katere so pokazali, da v polju UZ valovanja ne potujejo. Na podlagi obetavnih rezultatov so avtorji domnevali, da imajo GV sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici spremenijo njene akustične lastnosti, zaradi česar bodo celice, ki vsebujejo GV, doživele izrazito drugačno silo akustičnega sevanja kot tiste, ki GV ne vsebujejo. To bi omogočalo selektivno manipuliranje celic z UZ na podlagi njihovega genotipa [3].

Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo bakterijskih celic

V prvem delu eksperimenta so s plazmidom pET28a, ki vsebuje insert bARG1 (Acoustic Reporter Gene 1, sestavljen iz kombinacije 13 genov iz Ana in Bacillus megaterium, ključnih za nastanek GV), transformirali bakterijske celice E. coli. Tiste, ki so uspešno izražale GV, so označili s fluoresenčnim barvilom. Kot kontrolo so uporabili celice, v katerih so z izpostavitvijo visokemu tlaku predhodno počili GV. Po izpostavitvi celic stoječemu UZ valovanju so premik zaznali le pri celicah, ki so vsebovale GV. Te so se namreč pomaknile v območja ojačitve na steni mikrofluidnega kanala. Celice ter večina bioloških komponent ima v vodni raztopini pozitiven akustični kontrastni faktor Φ, vendar pa je ta zelo majhen (od 0.06 do 0.12). Rezultat zgornjega eksperimenta potrjuje, da prisotnost GV povzroči spremembo celotnega Φ celice, tako da ta postane manjši od nič, obenem pa reši tudi problem neodzivnosti majhnih celic na ARF. Celice, ki GV niso vsebovale, se namreč niso pomaknile nikamor (čeprav bi se zaradi pozitivnega Φ morale pomakniti v smeri območja oslabitve stoječega valovanja) [3].

Glede na obetavne rezultate so avtorji članka želeli preizkusiti, če je z UZ ob prisotnosti GV mogoča natančna in hitra prostorska manipulacija celic. Najprej so v za to posebej zasnovani akustični komori ustvarili vzorec stoječega valovanja ter vanjo dali raztopino fluorescenčno označenih celic, ki so vsebovale GV. Opazili so, da so se celice uredile v določen vzorec stoječega valovanja ter se po spremembi frekvence UZ v času nekaj sekund preoblikovale v novega. Nato so naredili še korak naprej in iz bakterijskih celic, ki vsebujejo GV, ustvarili akustični hologram. To je poimenovanje za tehniko, ki omogoča sestavljanje 3D objektov iz različnih vrst delcev samo z uporabo zvoka. Z uporabo 3D-natisnjene fazne maske so ustvarili profil visokega tlaka v obliki črke "R". Pripravili so 0,25 % raztopino agaroze v gojišču LB, ter vanjo dodali bakterijske celice, ki vsebujejo GV. Pri tem so temperaturo ves čas vzdrževali pri 37 °C, c čimer so preprečili gelacijo agaroze. Nato so raztopino izpostavili UZ ter pustili, da se je agaroza strdila. Kot pričakovano, so se bakterije znotraj strjenega gela imobilizirale v želenem prostorskem vzorcu 'R'. Uspešno so pokazali tudi, da lahko z UZ ustvarijo 'past', v katero se ujamejo celice, in s katero lahko povzročijo translacijo delcev v prostoru (podobno kot to zmore optična pinceta) [3].

Ekspresija plinskih veziklov omogoča selektivno akustično manipulacijo sesalskih celic

V nadaljevanju so raziskovalci preverili še, če enake lastnosti veljajo tudi za sesalske celice, ki vsebujejo GV. Pripravili so gensko spremenjene celice HEK293T, ki so pod inducibilnim tetraciklinskim promotorjem vsebovale zapis za mARG1. Kot kontrolo so uporabili celice HEK293T, ki so imele pod enakim promotorjem zapis za fluorescenčni protein mCherry. Ko so celice izpostavili UZ so ugotovili, da se je večinski del celic, ki vsebujejo GV, pomaknil v območja ojačitev, torej proti stenam kanala. Za razliko od bakterijskih celic, kjer ob odsotnosti GV v polju UZ valovanja niso opazili nobenega premika, so pri kontrolnih sesalskih celicah opazili, da so se te premaknile na območje oslabitev, torej v središče kanala. To je pričakovano, saj imajo celice pozitiven akustičnim kontrastni faktor Φ, poleg tega pa so sesalske celice večje od bakterijskih in posledično čutijo vpliv ARF. Naredili so tudi podoben eksperiment, kot so ga izvedli na bakterijskih celicah. Sesalske celice so transficirali s plazmidom, ki vsebuje zapis mARG1, ter jih izpostavili enakemu akustičnemu hologramu v obliki črke R kot prej bakterije. Tudi tukaj so opazili, da so se transficirane celice uredile v želeno obliko, medtem ko so se kontrolne celice od območja vzorca izrazito odmaknile. Ključno pri tem je dejstvo, da akustična manipulacija celic v vzorec ni vplivala na njihovo viabilnost [3].

V nadaljevanju so fluorescentno označene GV inkubirali z mišjimi makrofagi, ki imajo sposobnost endocitoze. Po izpostavitvi UZ so lahko selektivno manipulirali le celice, ki so uspešno prevzele GV. S tem so pokazali, da lahko GV služijo tudi kot biomakerji za neko določeno biološko funkcijo, v tem primeru endocitoze. Pokazali so tudi, da lahko GV delujejo kot markerji, ki omogočajo razvrščanje celic na podlagi njihovega genotipa v akustično-fluidni napravi. To bi lahko predstavljalo alternativo FACS, trenutno najpogosteje uporabljeni metodi za selekcijo celic na podlagi genotipa, ki zahteva drago in kompleksno opremo.

Zaključek

V raziskavi so pokazali, da plinski vezikli doživljajo močno silo akustičnega sevanja in delujejo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok, ki imajo sposobnost, da s svojo prisotnostjo v celici povečajo in izrazito spremenijo njen akustični kontrastni faktor ter s tem spremenijo njene akustične lastnosti. Prisotnost plinskih veziklov omogoča neposredno akustično manipulacijo bakterijskih celic z lovljenjem v akustično past in kontroliranim preoblikovanjem v želen vzorec stoječega valovanja ter selektivno manipulacijo bakterijskih in sesalskih celic na podlagi njihovega genotipa v želeno obliko (nastanek akustičnega holograma).

Predstavljeni rezultati dokazujejo sposobnost GV, da služijo kot prvi gensko kodirani aktuatorji za ultrazvok in tako povežejo akustično manipulacijo s področjem molekularne in sintetične biologije. Tehnologija predstavlja velik potencial na področju tkivnega inženiringa, kjer je cilj ustvariti funkcionalna tkiva oziroma organe z uporabo živih celic. Z uporabo biomolekularnih aktuatorjev bi lahko izboljšali učinkovitost in natančnost na področju regenerativne medicine. Tak pristop namreč v primerjavi z optičnimi in magnetnimi tehnikami manipulacije ponuja edinstvene prednosti – deluje v neprozornem mediju, je neinvaziven, ne vpliva na viabilnost celic ter omogoča fino prostorsko regulacijo in hitro odzivnost, poleg tega pa je tudi relativno cenovno ugoden.

Viri

[1] H. Bruus: Acoustofluidics 7: The Acoustic Radiation Force on Small Particles. Lab Chip 2012, 12, 1014–1021.

[2] J. Čemažar: Dielektroforetsko Ločevanje Bioloških Celic v Mikropretočni Komori : Doktorska Disertacija, Univ. v Ljubljani, Fak. za elektrotehniko, 2013.

[3] D. Wu, D. Baresch, C. Cook, Z. Ma, M. Duan, D. Malounda, D. Maresca, M. P. Abundo, J. Lee, S. Shivaei, et al.: Biomolecular Actuators for Genetically Selective Acoustic Manipulation of Cells. Sci. Adv. 2023, 9.