Rekonstitucija transkripcijsko-translacijskih sklopljenih DNA replikacij znotraj kompleksnih in vitro bioloških sistemov
Izhodiščni članek: Reconstituting transcription–translation-coupled DNA replication within complex in vitro biological systems
Uvod
Znanstveniki si prizadevajo preoblikovati in sintetizirati »žive« sisteme, ki so sposobni izkazovati temeljne značilnosti, kot so replikacija, metabolizem, organiziranje v razdelke in komunikacija. Kot temeljni okvir služi pretok genskih informacij iz DNA v RNA in proteine. V izbranem članku so predstavili sistem LoopReX (Zanka replikacije DNA in izražanja proteinov), platformo za izražanje genov brez celic (CFE) na osnovi ekstrakta E. coli dopolnjenega z DNA polimerazo, zasnovano za rekonstitucijo replikacije DNA, sklopljene s transkripcijo in translacijo (TTcDR) in vitro. Sistem združuje štiri ključne module: (1) replikacijo DNA, ki jo poganja DNA polimeraza bakteriofaga phi29 (phi29DNAP), (2) transkripcijo, ki jo posreduje RNA polimeraza bakteriofaga T7 (T7RNAP), (3) translacijo, ki jo podpirajo ribosomi in faktorji, povezani s translacijo, znotraj celičnega ekstrakta, in (4) umetni nukleoid, sestavljen z uporabo bakterijskega ogrodja CipB za prostorsko ločevanje DNA za učinkovitejše procese TTcDR.
Vzpostavitev LoopReX z rekonstitucijo TTcDR in vitro
Za vzpostavitev procesa TTcDR in vitro so izbrali sistem CFE na osnovi lizata E. coli. Celični lizati, ki vsebujejo široko paleto naravnih biomolekul in biokatalizatorjev, zagotavljajo kompleksno in dinamično okolje za rekonstrukcijo življenjskih procesov. V CFE sistem so vnesli DNA replikacijski mehanizem, kar so imenovali LoopReX. phi29DNAP kot stroj za replikacijo DNA so izbrali zaradi izjemno visoke procesivnosti in vrhunske natančnosti sinteze DNA, ki jo zagotavlja njegova sposobnost kontrolnega branja. Replikacija DNA v tem sistemu poteka preko amplifikacije s kotalečim se krogom. Najprej so kot matrično DNA uporabili krožno enoverižno DNA (cssDNA) in potrdili, da je phi29DNAP aktiven v sistemu CFE. Nato so matrično cssDNA zamenjali s krožno dvoverižno DNA (cdsDNA, pJL1-T7-sfGFP). Učinkovitost replikacije je bila opazno nižja za cdsDNA v primerjavi s cssDNA, kar nakazuje na to, da cdsDNA zahteva ločitev verig in sintezo začetnih oligonukleotidov za replikacijo (ki niso bili dodani reakciji) preden lahko phi29DNAP sproži proces replikacije DNA. V nasprotju s tem ti predpogoji že obstajajo v reakcijah cssDNA od samega začetka.
Analiza replikacije DNA in izražanja proteinov v LoopReX
Hkrati so analizirali replikacijo DNA in izražanje proteinov v sistemu LoopReX z matrico pJL1-T7-sfGFP v obdobju 6 ur. Opazili so, da sta se replikacija DNA in izražanje proteinov pojavili v različnih časovnih skalah. Vsebnost DNA je ostala visoka v prvi uri in se nato v naslednjih 5 urah postopoma zmanjševala, verjetno zaradi razgradnje, ki jo povzročajo nukleaze v celičnem lizatu. Kljub temu je LoopReX dosledno vzdrževal višje ravni DNA kot kontrolni sistem CFE. Izražanje proteinov pa se je v 5 urah enakomerno povečevalo, preden se je ustalilo. Izražanje proteinov v LoopReX je doseglo svoj maksimum prej kot v kontrolnem sistemu CFE, kar kaže na hitrejšo hitrost izražanja, ki ponuja prednosti v učinkovitosti. LoopReX torej prekaša sistem CFE tako pri replikaciji DNA kot pri izražanju proteinov, kar zagotavlja robustno platformo za nadaljnjo optimizacijo.
Mehanizem začetka replikacije DNA
Želeli so pojasniti mehanizem začetka replikacije DNA. Najprej so ugotovili, da na učinkovitost replikacije DNA in vitro neposredno vpliva količina T7RNAP. Za nadaljnjo raziskavo mehanizma začetka replikacije DNA s T7RNAP so konstruirali različne plazmide z zamenjavo originalnega promotorja T7 (φ10, razred III), uporabljenega v pJL1-T7-sfGFP, s promotorji različnih razredov. Že v prejšnjih študijah je bilo dokazano, da so se ti promotorji na osnovi T7 med transkripcijo obnašali različno, in proizvedli dve vrsti produktov RNA: abortivne transkripcijske produkte (kratke, nefunkcionalne verige RNA) in mRNA polne dolžine (uporabljajo se za sintezo proteinov). Predlagali so, da T7RNAP in njeni promotorji olajšajo proces začetka replikacije DNA z ustvarjanjem produktov RNA, ki služijo kot začetni oligonukleotidi (upoštevajoč, da se lahko mRNA polne dolžine razgradi tudi v kratke RNA z nukleazami) za replikacijo DNA.
Povečanje učinkovitosti replikacije DNA
Da bi povečali učinkovitost replikacije DNA in vitro, so konstruirali plazmide s tandemsko ponovljenimi promotorji, ki so zasnovani kot mesta za začetek replikacije DNA, kar se je izkazalo za učinkovito pri sprožitvi replikacije DNA. Vendar pa so opazili rahlo zmanjšanje izkoristka izraženih proteinov. To kaže, da uporaba promotorjev kot replikacijskih izhodišč uvaja konkurenčno dinamiko med replikacijo DNA in transkripcijo. Nadalje so ugotovilu, da ima tudi položaj promotorjev (tj. umetni ori) ključno vlogo pri uravnavanju replikacije in transkripcije DNA.
Optimizacija procesa TTcDR v LoopReX s pomočjo strojnega učenja
V sistemu LoopReX ima T7RNAP ključno vlogo pri sprožitvi replikacije DNA in spodbujanju transkripcije. Vendar pa in vitro procesi za replikacijo, transkripcijo in translacijo DNA pogosto zahtevajo različne in optimizirane pogoje. Za optimizacijo replikacije DNA in izražanja proteinov v LoopReX so uporabili strojno učenje, pri čemer so sistematično raziskali milijone možnih pogojev, da bi identificirali parametre, ki hkrati maksimizirajo učinkovitost obeh procesov. Za optimizacijo in silico so uporabili XGBoost (eXtreme Gradient Boosting), metodo ansambla, ki temelji na odločitvenem drevesu. Poleg tega XGBoost blaži prekomerno prileganje in izboljšuje posplošitev modela. Modele XGBoost so konstruirali za napovedovanje ravni replikacije DNA in izražanja proteinov z analizo vpliva dejavnikov iz standardnega protokola CFE, vključno z dodatnimi spremenljivkami, kot sta dNTP in DTT. Za potrditev napovedi so izbrali pet različnih reakcijskih formulacij in izvedli reakcije LoopReX. Eksperimentalni rezultati so pokazali dosledne trende tako v učinkovitosti replikacije DNA kot v učinkovitosti izražanja proteinov, ki so se ujemali z napovedmi modela. Formulacija z optimalno kombinacijo za učinkovito replikacijo DNA in izražanje proteinov, imenovana LoopReX-Opt, je bila nadalje raziskana. Opazili so, da se je vsebnost DNA v sistemu LoopReX-Opt v prvih 0,5 ure približno podvojila. Ekspresija proteinov se je v LoopReX-Opt znatno povečala, saj je dosegla največji izkoristek po samo 3 urah.
Umetni nukleoid izboljša delovanje in vitro TTcDR
V naravi imajo evkariontske in prokariontske celice svoje načine organizacije in zaščite DNA. Ključna razlika je v prisotnosti z membrano obdanega jedra pri evkariontih, medtem ko prokarionti vsebujejo nukleoid brez membrane. Raziskovalci so želeli zgraditi umetno, jedru podobno strukturo, da bi izboljšali delovanje in vitro TTcDR. Da bi to dosegli, so izbrali bakterijski kristalni inkluzijski protein (CipB), ki se spontano sestavlja s hidrofobnimi interakcijami in tvori proteinska ogrodja za pritrditev DNA. CipB so fuzirali s streptavidinom (tj. CipB-streptavidin), kar omogoča pritrditev biotinsko modificirane linearne dvoverižne DNA (ldsDNA). Ker nastali kompleks protein-DNA ni obdan z membrano, so ga poimenovali »umetni nukleoid«. Te strukture so se nadalje združile v grozde. Opazili so, da višje koncentracije proteinov zagotavljajo izboljšano zaščito DNA, saj CipB spodbujajo učinkovitejše prekrivanje in kompaktiranje DNA v umetne nukleoide, kar nato ščiti DNA pred razgradnjo z nukleazami v celičnem ekstraktu. Nadalje so konstruirali umetne nukleoide z uporabo matrične ldsDNA, ki vsebuje umetni ori in gen sfGFP. DNA je bila modificirana z biotinom na prednjem koncu, zadnjem koncu ali na obeh koncih. Najprej so ocenili učinkovitost vezave matrične DNA na umetne nukleoide in ugotovili, da so se vse DNA, modificirane z biotinom, vezale s skoraj 100-odstotno učinkovitostjo, medtem ko je nemodificirana ldsDNA pokazala izrazito nižjo učinkovitost vezave, verjetno zaradi nespecifičnih interakcij. Opazili so, da se je splošna učinkovitost TTcDR izboljšala z umetnimi nukleoidi, ki so vsebovali DNA. Najvišjo učinkovitost je dosegla dvojno biotinsko modificirana DNA, saj sta bila oba konca zaščitena z vezanim CipB, kar je preprečilo razgradnjo in omogočilo več matric za sintezo proteinov. Nato so v sistem LoopReX-Opt dodali dve dvojno biotinsko modificirani matrični ldsDNA za sočasno izražanje CipB-streptavidina in CipB-LacZ. Ta pristop je omogočil de novo, avtonomno tvorbo umetnih nukleoidov s samosestavljanjem na novo izraženega CipB-streptavidina, CipB-LacZ in dveh matričnih ldsDNA. Nastali umetni nukleoidni kompleks je pokazal dve ključni funkciji: CipB-streptavidin je olajšal pritrditev dvojno biotinsko modificirane ldsDNA, medtem ko je CipB-LacZ deloval kot encim za biokonverzijo. Poleg tega se je po treh krogih samorasti izrazilo in sestavilo več CipB-LacZ, kar je povzročilo povečanje katalitične aktivnosti za pretvorbo o-nitrofenil-β-D-galaktopiranozida (ONPG) v o-nitrofenol (ONP). Poleg tega so uspešno konstruirali dvo-encimsko presnovno pot s soizražanjem StyA (oksigenazna podenota stiren monooksigenaze) in SpEH (epoksid hidrolaza) s CipB-streptavidinom, ki se je samosestavil v umetne nukleoide in kataliziral pretvorbo stirena v (S)-1-fenil-1,2-etandiol. Ti rezultati skupaj dokazujejo, da je sistem LoopReX-Opt robusten za de novo, avtonomno tvorbo umetnih nukleoidov, kjer se več bioloških procesov – kot so replikacija DNA, izražanje proteinov, sestavljanje proteinov, vezava DNA in encimska kataliza (presnova) – dogaja na različnih časovno-prostorskih skalah.
Zaključek
LoopReX ohranja visoko učinkovitost izražanja proteinov v več ciklih in zagotavlja stabilnost skozi celoten proces, s čimer obravnava potencialne ključne omejitve, ki so ovirale razvoj umetnih življenjskih sistemov. Dodatne prednosti vključujejo znatne prihranke časa in stroškovno učinkovitost v primerjavi s proizvodnjo proteinov in vivo, saj za razliko od sistemov in vivo, LoopReX zaobide kloniranje in gojenje celic, kar omogoča sintezo proteinov neposredno iz DNA v nekaj urah. LoopReX ima v prihodnje velik potencial za gradnjo umetnih življenjskih sistemov, ki so sposobni izvajati medsebojno povezane celične funkcije. Ta sistem postavlja temelje za razvoj sintetičnih celic z vse bolj kompleksnim vedenjem, kot so samoreplikacija, evolucija in prilagajanje okolju. S tem širi možnosti biotehnoloških aplikacij, od razvoja naprednih terapevtskih sredstev do ustvarjanja biohibridnih sistemov in sintetičnih organizmov.
Literatura
Zheng, X., Gao, W., Liu, WQ. et al. Reconstituting transcription–translation-coupled DNA replication within complex in vitro biological systems. Nat Commun 17, 351 (2026). https://doi.org/10.1038/s41467-025-67411-2
