Primer X-inaktiviranega gena: O-GlcNAc transferaza

Delovanje encima in njegova funkcija

O-GlcNAc transferaza (OGT) je encim, ki pripenja N-acetilglukozaminske enote na proteine. Ta posttranslacijska modifikacija pomembno vpliva na njihovo aktivnost. OGT deluje kot senzor za povišano koncentracijo glukoze. Ko je v celici prisotna večja količina glukoze, se 2 do 3 procente glukoze v heksozaminski poti pretvori v N-acetilglukozamin. OGT ima funkcijo pripenjanja N-acetilglukozaminskih enot z O-glikozidno vezjo na serinske ali treoninske ostanke v proteinih. Proces dodajanja N-acetilglukozaminskih enot na te ostanke je dinamičen proces, saj obstaja nasprotno delujoči encim O-GlcNAcaza, ki pa razceplja O-glikozidno vez. Na proteine s serinskimi ali treoninskimi ostanki se poleg sadkorja lahko veže tudi fosfatna skupina. Kaj od tega dvojega se bo vezalo je odvisno od koncentracije glukoze in ATP. OGT deluje kot senzor glukoze ravno preko tega, da skrbi za ustrezno razmerje med fosforiliranimi in glikoziliranimi proteini, kar povzroči ustrezen odziv na povečano koncentracijo glukoze. Ker je v celici za fosforilacijo skrbi več kot tisoč različnih vrst kinaz, za dodajanje N-acetilglukozamina pa le OGT, je prisotnost in ustrezna količina le tega za celico zelo pomembna. Nepravilnosti v izražanju ali delovanju proteina OGT se tako kažejo v povezavi z nevrodegenerativnimi kot tudi metabolnimi boleznimi, ko so npr. diabetes tipa 2 ter razne kardiovaskularne bolezni.

Inaktivacija kromosoma X

Gen Ogt se nahaja na X kromosomu v bližini mesta XIC (X inaktivacijski center), kjer se inaktivacija prične. Ker se mora v celici tako moških kot žensk nahajati približno enaka količina OGT, je nujno, da pride ob inaktivaciji kromosoma X tudi do utišanja Ogt gena. Ta se tako zaradi svojega položaja relativno kmalu po začetku inaktivacije utiša. Inaktivacijo prične XIC s tem, da sintetizira nekodirajoče RNA (nrRNA), med katere spada tudi Xist RNA. Te se vežejo na več specifičnih mest na X kromosomu. Ko je posamezna Xist RNA vezana, se zaradi njene ustrezne koformacije na njo povežejo proteinski kompleksi PcG (ang. polycomb group protein). Kompleksi PcG so ključni pri epigenetskem utišanju genov. Povzročijo represivne modifikacije histonov in utišanje genov, s tem ko metilirajo lizin 27 na histonu H3, in ubikvitinirajo lizin 119 na histonu H2. Da pride do popolne inaktivacije pa poskrbijo drugi proteinski kompleksi, ki zamenjajo ubikvitiniran histon H2 z macroH2A. S tem je vezava DNA na histone še močnejša DNA se ni več zmožna odviti. Ta postopek se ponovi na sosednjih histonskih oktamerih in na ta način se veča delež heterokromatina, dokler ne pride do popolne inaktivacije (razen nekaterih genov) in nastanka barovega telesca.

Vpliv OGT pri inaktivaciji

Gen Ogt, ki zapisuje za O-GlcNAc transferazo se nahaja samo na kromosomu X. Značilnost tega gena je, da je pri sesalcih prisoten le v eni kopiji, se pravi, da se na enem kromosomu X se nahaja ena kopija gena Ogt. Ker imamo le en gen za ta encim in ker je njegova vloga v celici zelo pomembna, je ključnega pomena, da je njegovo izražanje močno nadzorovano za njeno normalno delovanje. Na to kaže njegov položaj na kromosomu, saj se nahaja v bližini lokusa Xist, ta pa je ključen za inaktivacijo samega X-kromosoma. Poleg tega pa njegovo nahajanje na spolnem kromosomu prispeva k spolno-specifičnim tveganjem za številne bolezni, saj imajo ženske na celico dve kopiji gena Ogt, in posledično se lahko v primeru nepravilne inaktivacije kromosoma X pojavijo različne nevrološke in metabolne bolezni, kot posledica njegovega nepravilnega izražanja. Encim OGT je epigenetski regulator in odkrita je bila povezava med encimom OGT in PcG kompleksom pri sesalcih, kar nakazuje vpliv encima OGT na transkripcijo. Encim OGT je pomemben pri trimetilaciji histona 3 na mestu K27 (lizin 27), da se tvori modifikacijo H3K27me3, saj to spremembo katalizira encim EZH2, del PRC2. Encim OGT O-GlcNAcetilira protein EZH2, komponento PRC2, ki je eden ključnih proteinov, ki sodelujejo pri inaktivaciji kromosoma X, na serinu 75 in ga s tem stabilizira ter olajša nastajanje te modifikacije. Nasprotno pa zmanjšanje koncentracije encima OGT vodi k zmanjšani pogostosti metilacije histonov. Ta modifikacija pa je ena najpomembnejših, ki sodeluje pri utišanju kromatina.

Embrionalni razvoj

OGT je tudi nujen za normalen embrionalni razvoj. Proces X-inaktivacije poteče že med zgodnjo embriogenezo, mehanizem pa poteka drugače v celicah embrionalnih in ekstraembrionalnih tkiv (tkiva, ki tvorijo posteljico). Posteljica se razvije iz tropoektoderma in v njem je skoraj vedno utišan očetov X-kromosom, kar je posledica starševskega vtisnjenja genov. Po drugi strani pa se v celicah notranje celične mase, iz katere se kasneje razvije embrio, inaktivira naključen kromosom X, se pravi ali očetov ali materin. Novejše raziskave pa vse bolj nakazujejo, da to povsem ne drži, saj je gen Ogt podvržen drugačni inaktivaciji kromosoma X v ekstraembrionalnih tkivih in da le-ta spada med tako imenovane gene pobegle X-inaktivaciji (ang. X chromosome inactivation-escaping genes). V mišjih trofoblastnih zarodnih celicah je bilo namreč dokazano bialelno izražanje gena Ogt. To pomeni, da imajo ženske posteljice višjo koncentracijo encima OGT in posledično več O-GlcNAcetiliranih proteinov kot moške. Posledice tega so še neraziskane. Da je encim OGT zelo pomemben so dokazali, ko so delali poskuse na miših, so ugotovili, da je izbitje gena Ogt letalno že v stadiju blastociste, se pravi okoli 5 dni po oploditvi. Dokazano je bilo tudi, da materin stres in njena dieta (dostopnost hraniv) predstavljajo tveganje za razvoj nevroloških in metaboličnih motenj. Pri teh motnjah so prepoznali nenavadno O-GlcNAcetilacijo pri različnih spolih. Primer tega so bili potomci miši, katerih mati je bila med zgodnjo gestacijo izpostavljena stresu. Ti so izražali občutno manj OGT-ja v posteljici, posledica tega pa je bilo spremenjeno izražanje genov v hipotalamusu, kar nakazuje povezavo med placentnim izražanjem OGT-ja in prisotnostjo nevroloških bolezni.

Razvoj bolezni

Prekomerno izražanje gena O-GlcNAc transferaze (OGT) je povezano z diabetesom tipa 2, debelostjo, avtoimunskimi boleznimi in rakom.

Rak

Rak kot primaren vir energije uporablja glikolizo, zaradi česar ima tudi povečano privzemanje glukoze v celico. Del glukoze vstopi v heksozaminsko biosintezno pot (HBP) , kar poveča koncentracijo UDP-GlcNAc. Povečana koncentracija UDP-GlcNAc povzroči povečano izražanje proteina OGT in glikozilacijo proteinov. Glikozilacija povzroči spremembe v interakcijah med proteini, zato lahko pride do sprememb v specifičnih kompleksih, ki nadzorujejo onkogene poti. Če inhibiramo glikozilacijo proteinov, pride do zmanjšanja rasti tumorja, upočasni se celični cikel in izražajo se inhibitorji. Inhibitor vpliva na izražanje transkripcijskega faktorja FoxM1, ki skrbi za celično delitev med razvojem organov. Nadzoruje prehoda G1/S (v fazi G1 celica raste in se pripravlja na celično delitev; v fazi S se podvoji DNA) in G2/M (v fazi G2 celica raste in se pripravlja na mitozo; v fazi M pride do nastanka hčerinskih celic). Transkripcijski faktor poveča tudi invazivnost celic preko metaloproteinov. Spremembe v privzemanju glukoze vplivajo na anabolne in katabolne poti preko glikozilacije proteinov mTOR (angl. mammalian target of rapamycin- anabolizem) in AMPK (angl. 5' AMP-activated protein kinase- katabolizem). Poskusi so pokazali, da zmanjšana količina proteina p53 (tumor supresor) poveča stopnjo glikozilacije proteinov in tako ne nadzoruje več onkogenega fenotipa.

Diabetes tipa 2

Diabetes mellitus je zmanjšano izločanje in/ali zmanjšana učinkovitost inzulina v tarčnih tkivih (rezistenca). Zaradi hiperglikemije pride do zastrupitve z glukozo, kar vpliva na beta-celice, tarčna tkiva, žile in ledvice. V maščevju inzulin povzroči, da gre OGT iz jedra v membrano in glikozilira proteine inzulinske signalne poti, kar vodi do desenzitizacije. V normalnih pogojih se glikozilira protein PDK1 (angl. 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1), ki poveča vnos glukoze preko prenašalcev GLUT-4 (angl. glucose transporter type 4). Pri povečani glikozilaciji ima pomembno vlogo IRS1 (angl. Insulin receptor substrate 1), ki prenaša signal od inzulinskega receptorja do kinaze. Slednja pretvori PIP2 v PIP3 (fosfatidil inozitol di- v trifosfat), ki fosforilira protein AKT (protein kinaza B). Glikozilacija onemogoči prenos signala, zato se zmanjšata fosforilacija proteina in vnos glukoze (zmanjša se izločanje prenašalcev GLUT-4). Glikozilira se tudi glikogen sintaza, s čimer se zmanjša njena aktivnost in dodatno poveča rezistenca na inzulin.

Endotelijske celice so meja med krvjo in okoliškim tkivom. Hiperglikemija poveča glikolizo, kar povzroči prevelike količine superoksida v mitohondriju, ki inhibira glikolizo (encim GAPDH- gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza). Tako se naberejo intermediati glikolize, ki sprožijo HBP in povečajo koncetracijo glikoziliranih proteinov npr. NO sintazo. Glikozilacija onemogoči njegovo fosforilacijo (aktivacijo) in zmanjša proizvodnjo NO. To povzroči erektilno disfunkcijo.

Avtoimunske bolezni

Avtoimunska bolezen lupus napade zdrava, normalna tkiva. Je posledica zunanjih dejavnikov, ki inhibirajo DNA metilacijo v celicah T. Metiltransferaze utišajo gen z metilacijo citozina v CG paru, kar stabilizira heterokromatin (represivna oblika kromatina). Oslabljena metilacija DNA povzroči izražanje nezaželenih ali nepotrebnih proteinov v celici. Tudi inaktiviran X-kromosom se demetilira in izraža OGT, kar povzroči povečanje glikozilacije. To lahko poslabša ali celo sproži bolezen.