PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil
Uvod
Nespecifična dostava zdravil vodi v razne nezaželene stranske učinke. IGEM skupina iz UCLA se je odločila pripraviti različne sistem, ki bodo omejili omenjene probleme. Izbrali so dva različna pristopa s katerim bi tarčno delovali na izbrano molekulo. Prvi pristop vključuje uporabo proteinskih kletk, drugi pa pripravo rekombinantni bakterij.
Proteinske kletke
Proteinske kletke so samosestavljajoče proteinske strukture, kjer se oligopeptidne podenote nekovaletno povežejo in tvorijo visoko organizirano strukturo s točno določeno geometrijo. Skupina je za osnovno proteinsko kletko izbrala dve, po geometriji različni proteinski kletki, PC-Quad in O3-33. PCQuad je tetraedrična proteinska kletka sestavljena iz 12 podenot, ki so med seboj nekovalentno povezana. Vsaka podenota je fuzija trimera bromoperoksidaze, dimera virusnega M1 iz matriksa in alfa vijačnice, ki je povezovalec obeh oligomerov. Slednja določi orientacijo obeh oligopeptidov in s tem omogoči samosestavljenje proteinske kletke. Kot, ki ga zavzema alfa vijačnica je v tem primeru 109,5°, velikost podenote je približno 50kDa, cela proteinska kletka pa ima premer 16 nm.
Oktaedrična proteinska kletka O3-33 je sestavljena iz 24 podenot s premerom 13 nm. Eno podenoto tvorijo trimerni proteini, ki tvorijo nizkoenergijska protein-protein stičišča. To je pogoj, da se lahko kletka po translaciji sama sestavi. Podenota kletke je velika približno 15 kDa.
Ker je glavni cilj skupine zagotoviti tarčno dostavo zdravil, so morali pripraviti ustrezne konstrukte, ki omogočajo to specifičnost. Slednjo lahko dosežemo z vključitvijo cepitvenega mesta, ki ga prepozna določena proteaza. Ob cepitvi z ustrezno proteazo, pride do razpada proteinske kletke in sprostitve zdravilne učinkovite ujete v kletki. Kot glavno tarčo so izbrali trombin, serinsko proteazo ki sodeluje v kaskadi strjevanja krvi. Z vklopitvijo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko, bi zagotovili da se vsebina kletke ne bi sprostila, dokler proteaza ne bi cepila. Trombin prepozna in cepi aminokislinsko zaporedje LVPRGS. Do tega bi prišlo samo na mestu nastanka krvnega strdka. Pri tem bi se sprostil antikoagulant, ki prepreči nastanek strdkov. Na ta način bi lahko zdravili trombozo in s tem nastanek srčnih zastojev ali kapi. V prvem koraku je skupina želela narediti ustrezne mutante obeh proteinskih kletk. Pri tem so morali upoštevati določene omejitve. Prva omejitev je bila ta, da vnos mutacij ne sme vplivati na sekundarno in terciarno strukturo podenote ter s tem na sestavljanje kletke. Druga omejitev je temeljila na dostopnosti cepitvenega mesta. Ta mora biti na zunanji strani kletke, kjer je manj steričnih ovir in zato tombin lahko dostopa do tega mesta. Zadnja omejitev pa velja samo za PCQuad proteinske kletke. Mutacije moramo vnesti blizu povezovalne regije, saj je večja verjetnost, da bo ob cepitvi kletka razpadla in sprostila vsebino. Na podlagi opisanih kriterijev je skupina pripravila 10 mutant PC Quad in 3 mutante O3-33 proteinske kletke.
Divji tip in vse mutante so pripravili tudi v obliki biokock, ki jih najdemo v registru. Gen, ki zapisuje za eno podenoto PCQuad je bil mutiran tako, da so vnesli trombin cepitveno mesto z reakcijo PCR. S pomočjo PDB datotek in programa Pymol so določili regije, ki le malo prispevajo k sekundarni strukturi, in regije na površini brez steričnih ovir. Biokocko sestavlja promotor T7, ribosom vezavno zaporedje, gen z vnesenim trombin cepitvenim mestom, histidinska oznaka in stop kodon. Mutante in divji tip PCQuad so kompatibilni z RCF 10, 21, 23 in 1000, O3-33 pa z RCF 10, 12, 23 in 1000. Biokocke so uspešno klonirali v vektor pSB1C3.
Sledilo je izražanje in validacija nastanka proteinske kletke s cepitvenim mestom za trombin. Izraziti so želeli 5 najboljših modelov PCQuad in 3 najboljše modele O3-33. Čiščenje proteina je potekalo preko histidinske oznake. Uspešno izražanje in čiščenje so potrdili s pomočjo PAGE. Izraziti in očistiti so uspeli oba divja tipa kletk, mutanti PCQuad M1 in M13 ter mutantno podenoto O3-33 aa88. Ostalih mutant niso uspeli očistiti. V naslednjem koraku so z metodo dinamičnega sipanja svetlobe preverjali ali je prišlo do samosestave proteinske kletke, hkrati pa so preverjali tudi čistost vzorca. Polmer proteinske kletke divjega tipa in mutant PCQuad je 8 nm, za O3-33 pa 6,5 nm. Pri divjem tipu ter mutantnem PCQuad M1 in O3-33 aaa88 so dokazali nastanek proteinskih kletk ustreznih velikosti. Pri PCQuad M13 ni prišlo do sestave večjih struktur, saj je DLS prikazal, da imajo nastale molekule premer približno 0,9 nm. Poleg polmera dobimo z DLS tudi podatke o polidisperzivnosti, ki povedo o čistosti analiziranih vzorcev. Vsi vzorci imajo polidisperzivnost manjšo od 30 %, kar pomeni, da niso vsebovali nečistoč.
V zadnjem koraku je skupina testirala razpad proteinskih kletk ob cepitvi s trombinom. PCQuad M1 in O3-33 aa88 podenoti, ki sta uspešno tvorili proteinske kletke, so cepili s trombinom. Testirali so različne koncentracije trombina in čas cepitve. Z SDS PAGE so preverili, če cepitev poteče na ustreznem mestu, z DLS pa ali je prišlo do razpada celotne kletke. Ob dodatku trombina k divjemu tipu proteinskih kletk ni prišlo do cepitve, saj podenote ne vsebujejo zaporedja, ki ga prepozna in cepi trombin. Pri cepitvi mutant, pa je prišlo do cepitve in s tem tudi razpada celotne proteinske kletke. Slednje so potrdili z DLS, saj sta se radij in porazdelitev molekul močno spremenila. Te dva podatka nakazujeta, da je prišlo do porušitve oz. razpada prvotne strukture.
Sistem super vojakov
Odpornost gramnegativnih bakterij na antibiotike predstavlja vedno večji problem. Antibiotiki poleg na patogen delujejo tudi na naravno mikrobioto. Širok spekter delovanja in problematika v razvoju novih učinkovin sta razloga, da je tarčno delovanje antibiotikov postalo pomembno. Od kontakta odvisna inhibicija rasti (CDI) je sistem, ki CDI+ sevom omogoča, da izpodrinejo oz. preprečijo rast sorodnih CDI- sevov. Imajo ga številne gramnegativne bakterije npr. Yershinia pseudotuberculosis in uropatogeni sevi Escherichie coli. Ta tip inhibicije je bil prvič opažen pri E. coli, EC93.
CDI sistem je pod vplivom gruče genov CdiBAI. Gen cdiB zapisuje za protein z zvitjem beta sodčka, ki eksportira protein CdiA skozi zunanjo membrano bakterij. CdiA je 319 kDa velik protein s hemaglutininskimi ponovitvami, ki po vezavi na receptor BamA, posredno vpliva na rast celic. Po vezavi pride do cepitve C končne CdiA-CT domene, ki se premesti v celico in inhibira rast tako, da v notranji membrani bakterij tvori pore. Receptor BamA najdemo v zunanji membrani vseh gramnegativnih bakterij in ima zvitje beta sodčka z variabilnimi zankami na ekstracelularni strani. Zanke se med vrstami razlikujejo in onemogočajo nespecifično delovanje CdiA proteina. Gen cdiI zapisuje za protein, ki prepreči odprtje CdiA-CT pore v notranji membrani in s tem avtoinhibicijo rasti.
Cilj skupine je bil translocirati tri različne CDI sisteme iz EC93 in Enterobacter aerogenes ATCC 13048 v laboratorijski sev DH5α, ki bo sposoben selektivno inhibirati rast teh dveh sevov. Laboratorijski sev s CDIEC93 bi inhibiral rast vseh bakterij, ki imajo prisoten receptor BamAE.coli. Da bi sistem deloval na EC93 (CDIEC93+), je potrebno zamenjati CdiA-CTEC93 domeno s C končno domeno iz ATCC 13048. V nasprotnem primeru bo protein CdiI EC93 preprečil inhibicijo rasti, saj bo prepoznal toksin (C končno domeno) in ga deaktiviral. V prvi stopnji je bilo potrebno izraziti CDI sisteme na plazmidih. Izhodiščni material sta bila 2 kozmida z zapisi za CDI sistem iz EC93 oz. EC869, s katerima so transformirali seva EPI 100 IN X90. Prav tako so s kozmidoma transformirali DH5α. Nadaljevali bi z vnosom CDI sistemov iz Enterobacter aerogenes v DH5α. V primerjavi s prejšnjimi poskusi, bi v tem primeru sami skonstruirali plazmid. V vektor pSK33 bi vstavili zapis za CDI sistem s spremenjeno C končno domeno in ustreznim cdiI. Delovanje sistema CDI so prikazali s pomočjo kompetitivnega testa, kjer so opazovali število kolonij CDI+ sevov v primerjavi s CDI- sevi. Uspelo jim je pokazati, da so bakterije DH5α uspešno izražale sistem CDIEC93 in CDIEC869 ter tako inhibirale rast tarčnih celic. Priprava vektorja pSK33 z ustreznim zaporedjem je bila neuspešna.
Poleg že opisanih ciljev, so se ukvarjali še z naslednjimi izzivi. Ugotovljeno je bilo, da so C končne domene moduli. Z uvedbo restrikcijskih mest, bi lahko sistematično modulirali C končno domeno CdiA-CT.
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 ima 2 CDI lokusa. S pomočjo transpozonske mutageneze bi lahko določili tarčne receptorje za posamezen CDI sistem.
Zaključek
Skupina je za projekt proteinskih kletk prejela zlato medaljo v kategoriji »Proof of Concept«. Z uvedbo cepitvenega mesta za trombin v proteinsko kletko so pokazali, da po cepitvi s trombinom pride do razpada kletke. Projekt ima velik potencial, saj bi namesto trombina lahko uporabili vrsto drugih proteaz in tako nekoč tarčno dostavljali mnogo zdravilnih učinkovin. S pripravo biokock pa so olajšali delo naslednjim generacijam, ki se bodo ukvarjale s tarčno dostavo zdravilnih učinkovin.
Viri
iGEM 2016: PC SQUAD-Engineering new sistems of targeted drug delivery, dostopno na povezavi: http://2016.igem.org/Team:UCLA
