Diagnostična vrednost rekombinantnega proteina Tp0821 v serodiagnostiki sifilisa

Sifilis je spolno prenosljiva bolezen, ki jo povzroča spiralna bakterija Treponema palidum. Okužba se lahko prenese s krvjo (tudi preko placente), preko sluznice ali poškodovane kože. Bolezen nastopa v več stopnjah [1], ki se kažejo v različnih kliničnih znakih in predstavljajo težavo pri diagnostiki [2] [3]. Zdravljenje poteka z antibiotiki.

Sifilis diagnostificiramo na podlagi fizioloških znakov in s krvnimi testi, ki temeljijo na antigen – protitelo interakciji. Poznane so tudi metode direktne detekcije, kot so živalska inokulacija, mikroskopija v temnem polju prizadetega tkiva in PCR vzorca s področja čankar, vendar pa te niso vedno možne. Dva večja problema v serodiagnostiki sifilisa sta prenizka specifičnost povezave protitelo - antigen, ki da lažno pozitivne rezultate predvsem pri infekcijah z drugimi spiralnimi bakterijami, in prenizka občutljivost, ki da lažno negativne rezultate pri diagnostiki določenih fazah bolezenskega stanja [4].

Kljub velikemu številu testov za diagnostiko sifilisa, pa do danes še ni enega samega zadostnega testa, zato diagnozo največkrat postavimo na podlagi fizioloških znakov in rezultatov več različnih serodiagnostičnih testov. Da bi zaobšli nesigurnosti in omogočili avtomatizacijo diagnostike sifilisa, so kitajski znanstveniki preverjali diagnostično vrednost metode ELISA z rekombinantnim proteinom Tp0821, ki vpliva na nastanek specifičnih protiteles skozi vse stadije bolezni.

Materiali in metode

• Bakterija Treponema palidum in serološki vzorci: Ker je bakterijo Treponema palidum (TP) nemogoče gojiti v in vitro pogojih, je bila bakterija TP namnožena v novozelanskem belem zajcu. V raziskovalne namene so bili pridobljeni krvni vzorci 665 oseb, od tega 176 od pacientov s primarnim sifilisom, 257 od pacientov s sekundarnim sifilisom, 30 od pacientov z latentnim sifilisom, 115 od pacientov s kongenitalnim sifilisom in 52 od neinfektiranih oseb. Prav tako je bilo z namenom preverjanja občutljivosti v raziskavo vključenih 5 oseb z leprospirozo in 30 oseb z boreliozo brez sifilisa.

• Standardne diagnostične metode:Standardni testi PRP, CIA in TP-PA so bili opravljeni s komercialnimi kiti na vseh 665 vzorcih. Vsak test je bil opravljen dvakrat.

• Pridobivanje rekombinantnega proteina: Gen z 807 bp za protein Tp0821 je bil pomnožen s PCR s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi z dodanimi BamHI in XhoI restrikcijskimi mesti ter zaporedjem za histidinski rep. Pomnožek je bil kloniran v ekspresijski vektor pET-28a pod T7 promotor z lac operatorjem in vnesen v E. Coli BL31. Pozitivni klon je bil potrjen s sekvenciranjem. Rekombinantni protein je bil izoliran iz celic prekonočne kulture z dodanim IPTG induktorjem in s kovinsko anfititetno kromatografijo na nikljevi koloni.

• SDS – page in Western prenos:Uspešnost izolacije rekombinantnega proteina Tp0821 je bila preverjena s SDS-page in Western prenosom. Za detekcijo so bila uporabljena primarnima protitelesa iz seruma človeka, seruma zajca in anti-His monoklonska telesa ter sekundarna protitelesa s hrenovo peroksidazo (HRP) označena kozja antihumana IgG, HRP – označena kozja antihumana IgM, HRP – označena kozja antizajčja IgG in HRP – označena kozja antimišja IgG. Detekcija kemoluminescence je bila opravljena z uporabo SuperSignal West Pico kemoluminescentnega substrata. Prav tako je bila z Western prenosom preverjena specifičnost Tp0821 z vsemi krvnimi vzorci.

• ELISA:Ploščam pripravljenim z rekombinantnim proteinom ja bil dodan v treh ponovitvah ustrezno rečen krvni serum in HRP – označena kozja antihumana IgG in HRP – označena kozja antihumana IgM. Po dodatku tetrametilbenziodina in žveplove kisline je bila encimska rekcija merjena pri 450 nm.

Zaključki

Pri testiranju 578 bolnikov s sifilisom z različnimi komercialnimi seriodiagnostičnimi testi (RPR, CIA in TP-PA) in IgG ELISA ter IgM ELISA z rekombinantnim proteinom Tp0821 je bilo dokazano, da je najvišja pozitivna detekcija z IgG ELISA (98,3 %). IgM ELISA je imela enako uspešnost kot ostali komercialni serodiagnostični testi, vendar pa je pri testu specifičnosti pri treh zdravih posameznikih z liptospirozo bil pozitiven rezultat. IgG ELISI ni pokazala lažnih pozitivnih rezultatov v nobenem primeru in je bolj specifična kot ostali komercialnimi seriodiagnostičnimi testi. Rekombinantni protein Tp0821 primeren za serodiagnostiko sifilisa. Prednost rekombinantnega proteina Tp0821 je visoka specifičnosti in občutljivost ter omogoča detekcijo okužbe v vseh stadijih bolezni. Rekombinantni protein Tp 0821 predstavlja novo potencialno diagnostično molekulo, uporabljen z ELISA metodo pa tudi avtomatizacijo diagnostike sifilisa.