Struktura in mehanizem restriktaz tipa II

UVOD

Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.

RESTRIKTAZE TIPA II

Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP. Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. EcoRI in RsrI: G|AATTC). Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati. • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so EcoRI, EcoRV in BglI. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je FokI. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi. • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je DpnI.