Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode
Uvod
Onesnaženje s težkimi kovinami je problem s katerim se spopadamo na svetovni ravni. Dejavnosti, kot so rudarjenje in taljenje rude, razne industrije (plastika, galvanizacija, tekstil, elektronka, …), kmetijstvo in odlaganje odpadkov (blato čistilnih naprav, izlužki iz deponij, kovinski odpadki, …), pripomorejo k izločanju težkih kovin v okolje. Težke kovine, kot so na primer Cu, Pb, Cd, Hg, Cr (VI), As …; se za razliko od organskih snovi ne razgrajujejo, temveč se v okolju akumulirajo. Poleg tega so to pogosto za organizme neesencialni elementi in lahko povzročajo resne zdravstvene težave [1,2].
V vodi se težke kovine sicer akumulirajo v nižjih koncentracijah (manj kot 1 mg/L), vendar še vedno predstavljajo nevarnost za okolje in človeško zdravje. Uveljavljene metode za odstranjevanje težkih kovin so: ionska izmenjava, membranska filtracija, precipitacijske metode in elektrokemijske tehnike. Precipitacija omogoča 99 % odstranjenje težkih kovin, ampak povzroča sekundarno onesnaževanje vode. Elektrokemijske metode in ionska izmenjava sta učinkovita načina odstranjevanja težkih kovin, vendar potrebujeta drago opremo in veliko energije. Membranska filtracija sicer predstavlja dobro alternativo tem tehnikam, vendar ima kot vse ostale uveljavljene tehnike pomanjkljivost, saj ni uspešna pri odstranjevanju težkih kovin v nizkih koncentracijah. V tem članku so za ta namen so iz mikrobnih amiloidnih nanovlaken (MAN, Microbila Amyloid Nanofibers), ki so sposobni vezave težkih kovin, pripravili biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode [2].
Priprava biohibridnih membran
Mikrobna amiloidna vlakna (MAN)
Amiloidne fibrile navadno povezujemo z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot so Parkinsonova in Alzheimerjeva bolezen. Vendar te z β-strukturami bogate fibrile najdemo tudi v vlogah, ki so koristne organizmom. Tako imenovane funkcionalne amiloide najdemo pri človeku, glivah, še posebej pa so pogosti pri bakterijah. Tam nastopajo kot strukturni element biofilmov in so zaslužni za togost in adhezivne lastnosti teh struktur. Protein ki tvori amiloidne fibrile pri E. coli se imenuje curli. Ta tvori omrežje prepletenih fibril, ki obdajajo celice in tvori nekakšno membrano ki ščiti celice pred eksogenimi polutanti.
Za biosintezo curli vlaken so potrebni proteini zapisani na operonih csgBAC in csgDEFG. CsgA predstavlja največji strukturni element teh fibril, medtem ko csgB sodeluje pri nzkleaciji samih fibril. CsgC, csgE in csgF so šaperoni in csgG pa tvori proteinski kanal na zunanji membrani bakterije. Za tvorbo MAN so v tej raziskavi pripravili bakterije E. coli, v katere so vstavili vezje, s katerim so lahko regulirali izražanje csgA gena. To so naredili tako da so v plazmid pET22b vstavili zapis za csgA (ta je bil pod kontrolo lac operatorja) in z njim transformirali sev E. coli B21 [DE3]. Z dodatkom IPTG so v kulturi teh celic lahko inducirali tvorbo MAN.
Izboljšava MAN
Za izboljšanje adsorbcije težkih kovin na MAN, so tem dodali proteine ki so sposobni vezave težkih kovin. Fitokelatini (PCs, PhytoChelatins) so oligomeri gluttiona, ki jih sintetizira fitokelatin sintaza (PCS, PhytoChelatin Synthase), kot odgovor na prisotnost težkih kovin. Najdemo jih v rastlinah in glivah. Njihova naloga je, da zunaj celice kelirajo ione težkih kovin in jim tako preprečijo vstop v celico. Poleg fitokelatinov pa je bilo pokazano, da iscA (Iron-Sulfur Cluster Assembly) protein lahko veže tudi nekatere težke kovine.
Za vezavo teh dveh proteinov na MAN, so uporabili sistem SpyTag – SpyCatcher. Ta sistem deluje tako, da SpyTag, ki je 13 aminokislin dolg peptid, spontano tvori izopeptidno vez s svojim partenrjem SpyCatcher. Na C konec csgA so dodali SpyTag (pripravili so plazmid pET22b-csgA-SpyTag in z njim transformirali E. coli B21 [DE3]). Za kombinacijo SpyCatcher in PCS oziroma iscA pa so uporabili drug vektor, in sicer pET28a, pripravili so rekombinantna vektorja pET28a-SpyCatcher-PCS in pET28a-SpyCatcher-iscA ter z njima transformirali E. coli B21 [DE3]. S kombinacijo sevov so dobili membrano iz MAN, ki imajo vezana proteina PCS in iscA.
Biohibridne membrane
Same celice E. coli obdane z MAN so uspešne pri vezavi težkih kovin, ampak so za uporabo nepraktične. To so raziskovalci rešili tako da so jim dodali aktivno oglje. To mešanico so vakuumsko filtrirali da so dobili 0,22 μm adsorpcijski film na celulozni membrani. Tako so dobili končne biohibridne membrane.
Rezultati
Indukcija izražanja csgA in sestavljanje MAN
Celice so gojili v YES-CA gojišču. Izražanje csgA so sprožili z dodatkom IPTG (končna koncentracija 0,5 mM). Raven izražanje so spremljali preko barvanja z barvilom Congo rdeče na intervalu 48 – 72 h po indukciji. Za kontrolo so uporabili E. coli B21 [DE3] transformirane s praznim pET22b vektorjem. Maksimalno raven izražanja so opazili 72 h po indukciji. Rezultat indukcije so preverili tudi s presevnim elektronskim mikroskopom, kjer so opazovali morfologijo amiloidnih struktur zunaj celic. Za rekombinantni sev so pokazali večjo rast amiloidnih vlaken, kar je pomenilo da jim je uspelo pripraviti celice, ki so v povečani meri izražale csgA.
Sposobnost adsorpcije Pb na MAN
Vpliv časa na adsorpcijo so preverjali s koncentracijama svinca 50 mg/L in 100 mg/L. Raven adsorpcije je s časom naraščala in dosegla maksimum pri 6 h, sev ki je povišano izražal csgA je bil sposoben adsorbirati večeje količine Pb kot kontrola.
Preverjali so tudi vpliv pH na adsorpcijo. Raven adsorpcije se je z višanjem pH povečevala in imela maksimum pri pH = 6, na kar se je začela zniževati. Razlog je da pri nižjih vrednostih pH pride do tekmovanja za vezavo na MAN med protoni in ioni Pb. Tako so določili da je optimalen pH za odstranjevanje Pb ionov med 5 in 7.
Vpliv začetne koncentracije Pb ionov na adsorpcijo so preverjjali s koncentracijami od 100 mg/L do 1 mg/L. Sposobnost adsorpcije je z nižanjem začetne koncentracije najprej naraščala, nato pa je začela padati. Najboljša adsorpcija je bila pri začetni koncentracij 50 mg/L, kjer je bila 98,26%. Pri koncentracij 1 mg/L pa je bila sposobnost adsorpcije seva, ki je povečano izražal csgA skoraj enaka kontroli (okrog 10 %). Kar kaže, da so bili sevi ki povišano izražajo csgA neobčutljivi na nizke koncentracije težkih kovin.
Izboljšava MAN
Celice ki so bile transformirane s pET28a-SpyCatcher-PCS (oz. iscA), so gojili do OD600 = 0,6 – 0,8, nato so dodali IPTG (končna koncentracija 0,75 mM). Po 20 h indukcije so celice lizirali in ta lizat dodali v gojišče za celice transformirane s pET22b-csgA-SpyTag. S TEM so pokazali so da prisotnost SpyTag ne vpliva na sestavljanje MAN. Pokazali so tudi, pride do stabilne povezave med csgA-SpyTag in SpyCatcher-PCS(iscA).
Sposobnost adsorpcije so najprej preverili za Pb ione z začetno koncentracijo. Po 6 h je bila adsorpcija za kombinacijo MAN-iscA 10 % (podobno kot kontrola), medetem ko je bila za kombinacijo MAN-PCS 90 %. To je pokazalo da je za odstranjevanje težkih kovin upporabna kombinacija MAN in PCS. S to kombinacijo so ponovili tudi eksperiment za vpliv pH in ugotovili da je optimum med pH 5 in 7.
Nato so preverili adsorpcijseke sposobnosti MAN-PCS za ione bakra, kadmija in svinca pri različnih začetnih koncentracijah težkih kovin, in sicer 0,8 mg/L, 1 mg/L in 1,2 mg/L. Najboljši rezultati so bili za Cd ione kjer so dobili 91,85 % adsorpcijo. Na splošno pa so je bila sposobnost adsorpcije pri sevih s kombinacijo MAN-PCS boljša v primerjavi s kontrolo.
Biohibridna membrana
Adsorpcijske sposobnosti so preverjali pri koncentraciji težkih kovin (Pb, Cu in Cd) 1 mg/L. Adsorpcija je bila po 6 h za Cd 98,7 %, za Pb 95,33 % in za Cu 85,67 %.
Ker lahko v realnih vzorcih pride do interferenc z drugimi komponentami so izvedli še poskus s simulirano odpadno vodo, v katero so dodali težke kovine do koncentracij 1 mg/L. Sosobnost adsopcije Cd je bila še vedno nad 90 %, za Cu in Pb pa je bila nad 80 %. Kar kaže na dobor robustnost te membrane.
Testirali so tudi sposobnost večkratne uporabe te membrane. Rezultati so pokazali da je po 8 uporabah sposobnost adsorpcije Cd in Pb nad 80 % in Cu 75 %
Zaključek
V tej študiji so pripravili samo-sestavljajoča mikrobna amiloidna nanovlakna, ki so bila sposobna vezave težkih kovin pri koncentraciji 50 mg/L. Pripravili so tudi pripravili fuzijo teh MAN s proteinom PCS, ki je omogočala adsorpcijo v nižjih koncentracijah težkih kovin. Na koncu pa so pripravili biohibridno membrano s temi izboljšanimi MAN, ki je bila sposobna adsorpcije težkih kovin pri nizkih koncentracijah in je bila hkrati robustna in omogočala večkratno uporabo.
Viri
[1] N. Romih, B. Grabner, and C. R. Č. Lasnik, “Remediacija onesnaženih tal s težkimi kovinami,” pp. 1–8, 2002.
[2] D. Zhao, Z. Peng, J. Fang, Z. Fang, and J. Zhang, “Programmable and low-cost biohybrid membrane for efficient heavy metal removal from water,” Sep. Purif. Technol., vol. 306, no. PB, p. 122751, 2023, doi: 10.1016/j.seppur.2022.122751.
[3] T. V. Sønderby, H. Rasmussen, S. A. Frank, J. Skov Pedersen, and D. E. Otzen, “Folding Steps in the Fibrillation of Functional Amyloid: Denaturant Sensitivity Reveals Common Features in Nucleation and Elongation,” J. Mol. Biol., vol. 434, no. 2, 2022, doi: 10.1016/j.jmb.2021.167337.
[4] D. Klsa, “Responses of phytochelatin and proline-related genes expression associated with heavy metal stress in Solanum lycopersicum,” Acta Bot. Croat., vol. 78, no. 1, pp. 9–16, 2019, doi: 10.2478/botcro-2018-0023.
