Konjugacijski prenos plazmidov pri bakteriji Bacillus subtilis

Uvod

Konjugacija je najbolj pogost mehanizem za horizontalni prenos genov in kot taka tudi najbolj zaslužna za širjenje genov za virulenco, toksine in odpornost proti antibiotikom. Posledično je eden izmed ciljev sodobnih raziskav na področju molekularne biologije razumevanje mehanizmov, po katerih konjugacija poteka. Medtem ko so procesi njene regulacije pri Gramnegativnih bakterijah, katerih predstavnica je E. Coli in njen plazmid IncF, že dokaj dobro raziskani, pri Grampozitivnih bakterijah ni tako. Nova odkritja na področju konjugacijskega prenosa plazmidov pri G+ bakteriji Bacillus subtilis bi lahko pripomogla k zmanjšanju te vrzeli.

Konjugacija pri Bacillus subtilis

Pri procesu konjugacije sodeluje ogromno število različnih proteinov, nastanek katerih mora celica skrbno regulirati. Genski zapis za te konjugacijske proteine je lahko bodisi integriran v bakterijski kromosom ali pa je ohranjen na plazmidu, kakršen je tudi plazmid pLS20, najden v bakteriji Bacillus subtilis. Začetne raziskave pri tem bacilu so pokazale, da mora biti potek konjugacije pri njem strogo reguliran, saj je bila konjugacija ves čas blokirana razen v ozkem časovnem intervalu na koncu eksponentne rasti celic.

Rco_pLS20 deluje kot represor konjugacijskega operona

V plazmidu pLS20 so nekateri geni izkazovali podobnost z že znanimi konjugacijskimi geni. Izkazalo se je, da ti geni spadajo pod isti operon, ki zajema gene od 28 do 74. Sekvenciranje ter in silico analiza plazmida sta nakazali, da bi transkripcijo na tem operonu lahko reguliral protein Rco_pLS20, ki ga zapisuje gen 27c, saj se gen nahaja pred operonom in mu je nasprotno usmerjen, njegovo zaporedje pa je podobno zaporedju za transkripcijske regulatorje Xre, ki imajo heliks-zavoj-heliks domeno. Z eksperimenti, kjer so opazovali izražanje RNA konjugacijskih genov pri različnih koncentracijah domnevnega regulatorja, so potrdili represorsko funkcijo Rco_pLS20.

Sestava operatorske regije konjugacijskega operona

V regiji med genoma 27c (represor Rco_pLS20) in 28 (konjugacijski operon) se nahajata dva promotorja: močan promotor Pc za prepisovanje konjugacijskega operona in šibek promotor Pr za prepisovanje Rco_pLS20. Promotorja sta nasprotno usmerjena in se prekrivata, kar pomeni, da bi se brez drugih dejavnikov (beri: regulatorjev) RNA polimeraza vezala samo na močnejši Pc. V okolici promotorjev so našli 10 polj z 8 bp dolgim zaporedjem CAGTGAAA, na katera se lahko veže Rco_pLS20. Polja se nahajajo v dveh regijah, ki nosita funkcijo operatorjev. Prvi operator (O₁), ki vsebuje 4 Rco vezavna mesta, se nahaja na območju med genom 28 in promotorjema. Drugi operator (O₂) s 6 RcopLS20 vezavnimi mesti pa se nahaja 75 bp stran od O₁ in se prekriva s promotorjema. Operatorja sta med sabo nasprotno usmerjena, medtem ko so Rco vezavna mesta v posameznem operatorju enako orientirana.

Mehanizem Rco_pLS20 represije vključuje nastanek DNA zanke

Položaj in usmerjenost operatorjev sta sprožila sum, da Rco_pLS20 z vezavo na operator povzroči nastanek DNA zanke in s tem inhibira promotor Pc. Čeprav je za nastanek zanke potrebnih najmanj 90 bp DNA, razdalja med operatorjema pa je 75 bp, bi bila zanka v tem primeru vseeno možna, saj je vijačnica med operatorjema predhodno upognjena. Raziskave so pokazale tudi, da protein Rco_pLS20 v raztopini tvori tetramere. To dejstvo je skupaj z rezultati testa zamika elektroforezne mobilnosti za regulatorno regijo z vezanim Rco_pLS20 omogočilo določitev modela vezave Rco_pLS20. Tetramer Rco_pLS20 se veže na posamezni operator. Dva tetramera se nato povežeta (tvorita oktamer) in tako ustvarita DNA zanko. V tej konformaciji regulatorne regije je promotor Pc blokiran, kar omogoča vezavo RNA polimeraze na promotor Pr.

Viri

Meijer, Wilfried J. J., idr. „Multiple Layered Control of the Conjugation Process of the Bacillus subtilis Plasmid pLS20“. Frontiers in Molecular Biosciences, let. 8, marec 2021, str. 648468. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.3389/fmolb.2021.648468.

Ramachandran, Gayetri, idr. „A Complex Genetic Switch Involving Overlapping Divergent Promoters and DNA Looping Regulates Expression of Conjugation Genes of a Gram-Positive Plasmid“. PLoS Genetics, uredil Danielle A. Garsin, let. 10, št. 10, oktober 2014, str. e1004733. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004733.

Singh, Praveen K., idr. „Mobility of the Native Bacillus Subtilis Conjugative Plasmid pLS20 Is Regulated by Intercellular Signaling“. PLoS Genetics, uredil Josep Casadesús, let. 9, št. 10, oktober 2013, str. e1003892. DOI.org (Crossref), https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1003892.