Proteus
Proteus je projekt, s katerim je ekipa z Univerze McGill sodelovala na tekmovanju iGEM 2023.
Avtor povzetka: Gašper Struna
Uvod
Število rakavih obolenj se z vsakim letom povečuje. Rak med drugim predstavlja tudi veliko finančno breme. Predvideva se, da naj bi stroški zdravljenja v naslednjih tridesetih letih znašali 25 bilijonov dolarjev. Za zdravljenje raka se je leta 2019 v ZDA porabilo 21,09 milijarde dolarjev. Poleg ekonomskega vidika pa ima rak velik vpliv na družine, ki jih prizadane. Nastanek raka na ravni genov je povezan z mutacijami, ki motijo celične procese in omogočajo nekontrolirano rast. Trenutna zdravljenja, kot so operacija, kemoterapija, radioterapija, večinoma le olajšajo, ne pa ozdravijo, bolezni. Rakave celice so med drugim tudi zelo prilagodljive in lahko zmanjšajo učinkovitost zdravljenja. Dinamična narava raka zahteva inovativne pristope, ki bi lahko izboljšali rezultate pri pacientih. V projektu Proteus so zasnovali in preizkusili nov inovativen pristop za zdravljenje raka trebušne slinavke.
Cilji projekta
Cilj projekta je bil ustvariti terapijo za zdravljenje raka trebušne slinavke, ki bi specifično prepoznala točkovne mutacije KRAS (mutacije značilne za rakave celice) in sprožila celično smrt rakavih celic, hkrati pa ne bi škodovala zdravim celicam.
Piroptoza
V projektu so se odločili, da bodo poskušali sprožiti imunski odziv v sicer imunosupresivnem okolju tumorja. Imunski odziv se lahko sproži s tem, da iz celice začnejo izhajati snovi, ki se tam ne bi smele znajti. V okolje lahko take snovi pridejo zaradi smrti celice. Poznamo več tipov smrti celice. V splošnem jih lahko razdelimo na programirano celično smrt in neprogramirano celično smrt. Tu se bomo osredotočili na programirano celično smrt (PCS), ki jo lahko potem nadalje razdelimo na več različnih tipov. Verjetno najbolj znana oblika PCS je apoptoza, pri kateri celice umrejo na omejen in urejen način. Ta tip PCS zato ne sproži imunskega odziva. Apoptozo uravnava družina proteinov kaspaze. Ta družina pa prav tako uravnava drug tip PCS, in sicer piroptozo. Tu pa pride do vnetnega odgovora. Vnetne kaspaze pri piroptozi razcepijo družino proteinov, imenovanih gasdermini.
Gasdermini
Gasdermini so progini sestavljeni iz N- in C-končne domene. N-končna domena je citotoksična in prek linkerja povezana z avtoinhibitorno C-končno domeno. Vnetne kaspaze razcepijo obe domeni in več prostih N-končnih domen se lahko vgradi v membrano, kjer skupaj tvorijo pore. Vsebina celic tako prek teh por preide v ekstracelularni prostor, kjer sproži vnetni odziv. Poznamo več različnih gasderminov, ki so v večini poimenovani z eno črko, in sicer gasdermin A, B, C, D, E itd. Gasdermini kažejo različne vloge pri raku. Visoka izraženost gasdermina B je povezana z napredovanjem raka, medtem ko ima gasdermin D tako spodbujevalne kot zaviralne lastnosti. Predvsem pa je zanimiv gasdermin E, saj njegovo delovanje upočasni rast tumorjev in poveča infiltracijo limfocitov v tumorje. Izražanje gasdermina E je pri rakih epigenetsko utišano. Njegova uporaba za terapije za zdravljenje raka je tako zelo obetavna.
Craspase
CRISPR in s CRISPR-Cas povezane tehnologije so zelo aktualna tema v bioloških znanostih. Ekipa iz Univerze McGill se je v svojem projektu osredotočila na sistem CRISPR tip III-E. Ta sistem prepozna ciljno RNA in posledično reže proteine. Tako kot ostali CRISPR sistemi se domneva, da služi kot obrambni mehanizem, vendar posledice cepitve proteinov s tem sistemom ne razumemo popolnoma. V projektu so uporabili sistem iz tega razreda, imenovan Craspase, ki je iz morskega anaerobnega organizma Desulfonema ishimotonii. Sistem ima pet glavnih komponent:
- efektor Cas7-11 – velik Cas protein, ki drži vodilno RNA
- vodilna RNA
- Csx29 – proteaza, ki reže tarčni protein
- tarčna RNA – komplementarna vodilni RNA
- Csx30 – tarčni protein
Csx29 reže Csx30 bližje C-terminalnemu koncu, in sicer natančneje med aminokislinskima ostankoma M427 in K429. Za razcep Csx30 ne potrebujemo celotnega proteina, ampak le aminokisline med 396. in 565. mestom. To je dobro za nadaljevanje, saj je bistveno lažje delati s krajšim proteinom/zaporedjem.
Zasnova
Sistem Craspase so v tem projektu uporabili tako, da je rezal gasdermin. Njihov načrt je bil, da ustvarijo fuzijski protein, ki bi vseboval obe domeni gasdermina, ki bi bili povezani s skrajšanim Csx30 (samo tistim delom, ki je ključen za rezanje s Csx29). Kot vodilno RNA pa bi uporabili zaporedje komplementarno zaporedju RNA z mutacijo KRAS. Sistem bi v celicah, ki vsebujejo tarčno RNA, sprožil piroptozo in s tem tudi vnetni odziv, ki bi uničil tarčne celice, netarčne pa bi ostale nedotaknjene. V eksperimentu bi uporabili fuzijske proteine z domenami gasdermina D in E. Za začetek so ciljali najbolj pogosto KRAS mutacijo G12D.
Eksperimentalni del
Najprej so reprogramirali S. cerevisae seva BY4741, da je posnemala človeški razvoj raka. Pripravili so 4 plazmide s konstrukti. Prvi plazmid je vseboval zapisa za Cas7-11 in gRNA, ki je bila komplementarna zaporedju, ki vsebuje mutacijo G12D. Drugi plazmid je vseboval Csx29 in zaporedje brez mutacije KRAS (KRAS wt), tretji plazmid je vseboval zapis za fuzijski protein, četrti pa zapis za zaporedje z mutacijo KRAS. Omenjeni zapisi na prvih treh plazmidih so bili pod kontrolo Gal1 in Gal10 inducibilnih promotorjev, zapis za zaporedje z mutacijo KRAS pa je bil pod kontrol inducibilnega DDI2 inducibilnega promotorja. Induktor tega promotrja je cianimid. Na ta način so lahko ločeno inducirali izražanje vseh konstruktov razen konstrukta z mutacijo KRAS. Opravili so več eksperimentov, kjer so uporabili fuzijska proteina gasdermina D in E. Del Csx30 potreben za rezanje so fuzirali direktno na N-končno domeno pred linker, drug konstrukt je imel zaporedje za linkerjem, pred C-končno domeno, tretji pa je imel zaporedje zarezanje na sredini linkerja. Inducirali izražanje proteinov in potem opazovali celice pod konfokalnim mikroskopom. Uporabili so dve barvili. Zelen fluorescein diacetat, ki obarva membrane celic, ki so še žive, saj je za obarvanje potrebna cepitev s hitinazo. Hitinaza pa bo cepila le v metabolno aktivnih celicah. Drugo barvilo pa je bil rdeč propidijev jodid, ki je majhna molekula, ki se veže na nukleinske kisline. To barvilo lahko obarva celice le, če vstopi vanje in to je možno le, če membrana vsebuje velike pore. Pri tem projektu so bile pričakovane večje pore sestavljene iz N-končne domene gasdermina. Pod mikroskopom je bila večina celic zelenih, če so v celicah izrazili celoten sistem brez plazmida, ki je vseboval zapis za fuzijski protein. Če so v celicah izrazili celoten Proteus sistem, pa je bilo vidno povečanje števila rdečih celic. Fluorescenco so potem analizirali in določili odstotek preživetja celic. Izkazalo se je, da je najboljše rezultate (v tem primeru nizko stopnjo preživetja) dal sistem, kjer so uporabili fuzijski protein gasdermin D in je bilo zaporedje za rezanje med linkerjem in C-končno domeno. Morfologijo celic s sistemom, ki je dal najboljše rezultate, so preučili pod vrstičnim mikroskopom. Videla se je morfologija značilna za celice, ki so podlegle piroptozi. Vidne so bile luknje v membrani in membrana, ki se je natrgala.
