Razvoj novih genskih orodij v metanotrofih

Uvod

Metan je eden najpomembnejših toplogrednih plinov. Njegov prispevek k povišani temperaturi na račun podnebnih sprememb je okoli 25 odstotkov [1]. Kljub temu gre za molekulo, ki ima velik potencial za biovalorizacijo, gre namreč za molekulo z visokim energijskim potencialom v bioloških sistemih (povprečna ΔG = -103,00 kJ/e- metana za oksidacijo z O2 pri T= 25°C, pH =7 [2]). V bioloških sistemih metan kot edini vir energije porabljajo aerobni ali anaerobni metanotrofi [1],[3],[4]. Metanotrofi so filogenetsko zelo raznolika skupina: predstavnike najdemo v bakterijskih razredih Alphaproteobacteria, Gamaproteobacteria in Verrucomicrobia [5]. Bakterijski predstavniki uporabljajo za končni prejemnik elektrona elektronske transportne verige O2. Poznamo tudi predstavnike v domeni arhej, ki so anaerobni metanotrofi in za končni prejemnik elektronov uporabljajo nitrat, sulfat in še nekatere druge. Metanotrofija se torej nahaja v zelo različnih ekoloških nišah. Pomembno je tudi dejstvo, da imajo različni taksoni z metanotrofi zelo različne anabolne poti. Vse uporabljajo formaldehid, ki nastane kot vmesni produkt oksidacije metana do CO2 kot osnovne gradnike za tvorbo kompleksnejših molekul z več C-atomov. Predstavniki razreda Gamaproteobacteria uporabljajo ribuloza monofosfatni cikel, predstavniki razreda Alphaproteobacteria uporabljajo serinsko pot, predstavniki razreda Verrucomicrobia pa nimajo encimov ne za eno ne za drugo pot, temveč za fiksiranje ogljika uporabljajo Calvinov cikel [5]. Te poti vodijo v različne oblike fiksiranega ogljika: serinska vodi do acetil-CoA, Calvinov in ribuloza monofosfatni cikel pa vodita do gliceraldehid-3- fosfata [5].

Methylococcus capsulatus Bath spada v razred Gamaproteobacteria in je bila izolirana iz vročih vrelcev v ZDA. Je eden prvih odkritih in najbolje proučenih metanotrofov [6]. M. trichosporium spada v razred Alphaproteobacteria. Je najbolje proučeni metanotrof s serinsko potjo fiksacije ogljika (tip II metanotrof [5]) [9]. Oba organizma sta biotehnološko zanimiva tudi zato ker proizvajata metan monooksigenazo v topni obliki (sMMO = »soluble methane monooxygenase«), kot tudi vezano na membrano (pMMO= »particular methane monooxygenase«) [6], [7],[9] in rasteta pri zmernih temperaturah (30°C, pH 6,5 [8],[9]). Zaradi svoje sposobnosti porabe le ene vrste spojine tako za katabolizem, kot tudi za anabolizem so metanotrofi biotehnološko zelo zanimivi, posebno v kontekstu valorizacije metana v koristne spojine. Dejstvo, da imamo že v naravi prisotne različne anabolne poti za tovrstni namen ponuja mnoge priložnosti. Izkaže se tudi, da so MMO filogenetsko najbolj sorodni amonijevim oksidazam (AMO) in da niso zelo specifični in lahko vršijo tudi oksidacijo amonijaka, halogeniranih alkanov, alkanov, alkenov in drugih spojin z zelo raznolikimi produkti [11]. Na žalost so nedavne raziskave pokazale, da vsaj v nekaterih nišah metanotrofni organizmi za delovanje metan monooksigenaze potrebujejo Cu2+, ki ga s posebnimi kelatorji »kradejo« denitrifikatorjem, ti pa ga potrebujejo za dejavnost encima, ki N2O reducira v N2 [4]. N2O je plin, katerega toplogredni učinek v 100 letih je 10-krat večji od metana, poskusi [4] pa so pokazali, da se pri 10-krat višji porabi metana količina sproščenega N2O za enkrat poveča, tako da se toplogredni učinek ravno izniči.

Kljub potencialni uporabnosti metanotrofov v valorizaciji, pa je nabor bioloških orodij za manipulacijo njihovega genskega materiala relativno boren. Poleg tega je pomanjkljiva tudi karkterizacija in nabor delov pomembnih za gensko manipulacijo v metanotrofih [1]. Trenutno v genski manipulaciji metanotrofov pomembno vlogo igrajo plazmidi širokega nabora gostiteljev (»broad host range« = BHR), ki imajo sposobnost prenosa preko konjugacije iz in v filogenetsko oddaljene organizme [6]. Tako lahko plazmide vnesemo in pomnožimo v bakteriji Escherichia coli, transformirane bakterije pa nato plazmide s konjugacijo prenesejo v metanotrofe. Uvajanje specifičnih mutacij preko izmenjave markerjev (»marker exchange mutagenesis«) lahko traja tedne [6]. Kot bolj uspešne se izkazale metode s protiselekcijo (»counterselection«), ki izločijo potrebo po izmenjavi različnih antibiotičnih rezistenc kot markerjev. Uporaba tovrstnih metod omogoča tako uvajanje velikega števila točkovnih mutacij kot tudi prenos daljših genskih fragmentov, na primer pri izmenjavi promotorjev. vendar pa večina laboratorijev teh metod ne uporablja in njihova učinkovitost ni bila potrjena za večino vrst metanotrofov [6]. Protiselekcijske metode omogočajo tudi uvajanje fenotipskih delecij kromosomskih genov insercijo genov za antibiotično rezistenco v dan gen v protiselekciji s saharozo za protiselekcijo celic, pri katerih je plazmid ostal vezan na kromosom [9].

Razpoložljiva orodja za manipulacijo metanotrofov

Trenutno igrajo pomembno vlogo v raziskovanju prisotnih in potencialnih genetskih elementov metanotrofov BHR plazmidi. Za metanotrofe pomembne BHR plazmide lahko razdelimo v dva tipa: replikativni plazmidi se pomnožujejo v metanotrofih. Za M. capsulatus Bath in M. trichosporium so raziskovalci razvili več različnih replikativnih plazmidov inkompatibilnostnih skupin P in Q [1]. Poleg replikativnih plazmidov pomembno vlogo igrajo tudi tako imenovani samomorilski (»suicide«) plazmidi. Ti se v metanotrofu ne pomnožujejo, njihova relativna koncentracija pa posledično pada z deljenjem celice. Vloga teh je vnos genskega materiala namenjenega rekombinaciji s kromosomsko DNA. Kljub temu, da se ne pomnožujejo v metanotrofu, pa so skonstruirani tako, da se pomnožujejo v E. coli [1].

Nativni promotorji, ki so povezani z najbolj izraženimi geni v metanotrofih so promotorji operona pMMO (PpmoC) in od kalcija odvisen promotor operona metanol dehidrogenaze (PmxaF). Izkaže se tudi da pogosto uporabljan promotor Ptac iz E. coli kaže na podobno aktivnost tem promotorjem ko nadzira izražanje v bakterijskih rodovih Methylotuvimicrobium, Methylococcus in Methylomonas [1]. Prav tako v je v nekaterih industrijsko pomembnih metanotrofih bila dokazana funkcionalnost nekaterih inducibilnih promoterjev odvisnih od alosterično reguliranih transkripcijskih faktorjev (TetR, Ara C). Študije delovanja teh promotorjev so omogočile tudi razvoj CRISPR-Cas sistema za določene metanotrofe [1].

Raziskava

V raziskavi [1] so za boljše razumevanje sistemov metanotrofov M. capsulatus Bath in M. trichosporium ter pripravo novih gentskih orodij za ta dva organizma:

• Kvantificirali število kopij pogosto uporabljenih replikativnih plazmidov pCAH01 (inkompatibilnostna skupina (Inc) P), pQCH (IncQ) in pBMTL-2, ki je plazmid, ki naj bi se dobro pomnoževal v vseh gram negativnih bakterijah in ima edinstveno inkompatibilnostno skupino pBR1 [10], v obeh organizmih.

• Uporabili plazmid pBBRMCS1-5 kot matrico za testiranje promotorjev iz Andersonove zbirke promotorjev, da bi dobili promotorje z različno aktivnostjo.

• V M. capsulatus so izvedli mutagenezo pMMO promotorja (Ppmoc2) in izolirali mutante, ki so imele drugačno aktivnost in jih sekvencirali. S tem so proučevali katera mesta so bistvena za vezavo RNA polimeraze hkrati pa pridobili serijo promotorjev za fino uravnavanje sistemov.

Materiali in metode

Na LB gojišču so kultivirali 2 seva E. coli (DH10b in S17-1λpir), ki so jih transformirali z izbranimi vektorji in selekcionirali s kanamicinom (50 μg/ml) (pCAH01, pQCH, PBMTL-2) ali gentamicinom (10 μg/ml) (pBBR1MCS-5). Te bakterije so nato uporabili za biparentalno parjenje z izbranimi sevi metanotrofov na NMS paritvenem agarju tako da so transformirano E. coli v razmerju 1:1 nanesli na kulture metanotrofov na ploščah. Metanotrofne transformante so nato selekcionirali na enakih koncentracijah antibiotika v za zrak neprepustnih epruvetah s koncentracijo metana v atmosferi 20%.

Za določitev števila plazmidov so s kitom izolirali 10ng DNA iz treh različnih transformiranih kolonij za vsak plazmid in zasnovali začetna oligonukleotida za kromosomski gen rpoB v obeh metanotrofnih sevih za kvantitativno PCR. V plazmidih so za kvantifikacijo pomnožili odsek gena za antibiotično rezistenco. Relativno število kopij oziroma število kopij plazmida na celico so določili s formulo: CN = 2^(C(plazmid)-C(genomska))

Plazmide za testiranje različnih promotorjev iz Andersonove zbirke so pridobili tako, da so v plazmid z Gibsonovim pristopom uvedli gen za rdeči fluorescenčni protein (RFP) in določen terminator (iGEM BBa_B00015). Sestavljen plazmid so združili z izbranimi promotorji iz zbirke in pomnožili. Za promotorje so uporabili majhno knjižnico mutacij konsenuzsnega promotorja (BBa_J23119) (promotorji BBa_J23100-119). Tistih, ki so v E. coli kazali na to, da nimajo aktivnosti, ali pa je njihova aktivnost bila v E. coli redundantna (enaka drugemu promotorju) niso sintetizirali, cilj je namreč bil doseči velik nabor različnih aktivnosti. S parjenjem so plazmide prenesli v metanotrofa in gojili do OD600 = 1. Nato so kulture prenesli v mikrotitrsko ploščo za spektrofotometrično analizo koncentracije RFP. Mutagenezo Ppmoc2 so izvedli tako, da so izvedli naključno mutagenezo tega promotorja iz genomske DNA s PCR kitom za naključno mutagenezo od regije -113 do +37, kar je vključevalo ključne regije -35, -10 in 50 nukleotidov nad in pod tema regijama. Produkte so združili s plazmidom pQCHPpmoC2-sfgfp, ki je vključeval tudi gen poročevalec GFP. Plazmid so pomnožili in transformirali v E.coli na gojišču s kanamicinom (50 μg/ml) za selekcijo. S parjenjem so plazmide prenesli v metanotrofa in gojili do OD600 = 1. Nato so kulture prenesli v mikrotitrsko ploščo za spektrofotometrično analizo koncentracije GFP.

Rezultati

V M. capsulatus Bath se plazmid pCAH01 pomnožuje najslabše (11 ± 1), temu sledijo plazmidi pBMTL-2 (56 ± 10) in pQCH (74 ± 10). Vsi plazmidi so se bolje pomnoževali v M. trichosporium, je pa relativni trend pomnoževanja v obeh organizmih podoben: v M. trichosporium se je najslabše pomnoževal pCAH01 (125 ± 78) nato pBMTL-2 (198 ± 140) in najbolje pQCH (401 ±239). Opazili so, da je visoko število kopij pQCH v transformantah M. trichosporium bila povezana z daljšim obdobjem razvoja kolonij (1 mesec pri pQCH transformantah in 1 teden pri transformantah ostalih plazmidov). Višje število plazmidov v M. trichosporium je bilo nepričakovano, saj netransformirana bakterija sama po sebi že vsebuje tri plazmide. Ti plazmidi pojasnijo tudi visoko relativno varianco med rezultati števila plazmidov M. trichosporium in M. capsulatus Bath, sklepajo namreč, da je stabilnost ohranitve teh plazmidov v M. trichosporium zaradi tekmovanja s prisotnimi plazmidi nižja. Sklepa se, da se druge plazmide istih kompatibilnostnih skupin vzdržuje na podobni ravni.