Molekulsko kloniranje

Predmet 3. letnika študijskega programa Biokemija. Izvaja se v zimskem semestru. Ima 30 h predavanj, 5 h semnarjev in 40 h laboratorijskih vaj, skupaj 5 kreditnih točk ECTS.

Nosilec predmeta: doc. dr. Marko Dolinar.

Vaje so ključni del predmeta. Letos jih bo predvidoma vodil nov asistent, ki pride na katedro v oktobru. Predmet je, poenostavljeno rečeno, polovica predmeta Tehnologija rekombinantne DNA iz starega programa, s tem da so vaje skoraj v celoti ohranjene, iz teorije pa je vključene dobra tretjina snovi.

Izpitni roki še niso določeni, vsekakor pa bosta dva v zimskem in po en v poletnem in jesenskem izpitnem obdobju.

Teme predavanj

1. Kloniranje, pojem biološke varnosti in omejitve pri delu.
2. Zgodovina molekularne biotehnologije. Laboratorijski organizmi.
3. Encimi pri delu z DNA.
4. Elektroforezne metode.
5. Vektorske molekule. Reporterski geni.
6. Sinteza DNA in vitro. Sinteza cDNA. Priprava DNA-knjižnic. Transformiranje celic.
7. PCR in izvedene tehnike.
8. Hibridizacija, sonde, načini označevanja DNA. Presejanje knjižnic. Mikromreže
9. Določanje nukleotidnega zaporedja DNA.
10. Ekspresijski sistemi. Transkripcija/translacija in vitro.
11. Izražanje v prokariontih: vektorji, fuzije, optimizacija proizvodnje. Usmerjena lokalizacija, topnost, stabilnost, renaturacija.
12. Izražanje v kvasovkah, insektnih in sesalskih celicah.
13. Mutageneza. Proteinsko inženirstvo.
14. Etični vidiki dela z rekombinantnimi molekulami DNA in družbena sprejemljivost gensko spremenjenih organizmov.

Teme seminarjev

Seminarji bodo vključeni v termine predavanj, obdelali pa bomo nekatere ključne dosežke iz zgodovine molekulskega kloniranja. Del seminarjev bomo izvedli z delom po skupinah in poročanjem. Posebna tema seminarjev - za delo doma - bodo ocene tveganja za delo z GSO.

Teme laboratorijskih vaj

Navodila za vaje boste dobili pred začetkom vaj v formatu PDF. Teme vaj bodo:

1. Primerjava dveh metod za izolacijo plazmidne DNA, vloga dodatkov, agarozna elektroforeza.
2. Načrtovanje začetnih oligonukleotidov, konstruiranje rekombinantnih molekul (računalniška vaja).
3. Izolacija plazmidne DNA v srednjem merilu in ocena koncentracije.
4. Preparativno rezanje plazmidne DNA z restriktazami.
5. Izolacija DNA iz agaroznega gela.
6. Priprava kompetentnih celic.
7. Ligacija fragmentov DNA in transformacija bakterij. Analiza transformant.
8. Indukcija izražanja rekombinantne DNA.
9. Analiza topnosti rekombinantnega proteina. Lokalizacija rekombinantnega proteina in test biološke aktivnosti.

Vaje bodo dvakrat tedensko po 5 ur in bodo trajale 5 oz. 6 tednov. V vsaki skupini bo največ 12 študentov.

Ocenjevanje

Ocena je sestavljena iz 5 % za seminar, 10 % za poročila z vaj, 35 % za kolokvij z vaj in 50 % za teorijo. Izpit je pisni in ustni. Popravljanje ocene je možno samo s ponovnim pisanjem izpita in hkrati kolokvija. Pogoj za opravljen izpit je, da iz teorije dosežete najmanj 50 % točk, da ste pripravili seminar, bili na vseh vajah in ste oddali poročila z vaj. Meje med ocenami bodo: do 9 % 1, do 19 % 2, do 29 % 3, do 39 % 4, do 48 % 5, do 58 % 6, do 68 % 7, do 77 % 8, do 86 % 9, 87 % ali več 10. Če se kdo prijavi na izpit, pa se potem ne odjavi, ne vračam prijavnice, vas pa odjavim, če to odločitev sporočite do trenutka, ko dobite v roke izpitna vprašanja oziroma po e-pošti do razpisane ure izpita.

Primeri sestavljanja ocene:

Prvi primer: Seminar 8, poročila z vaj 9, vprašanja z vaj 7, teorija 57 %. Ocena se sestavi takole: 8*0,5 + 9*1 + 7*3,5 + 57*0,5 = 4 + 9 + 24,5 + 28,5 = 66, kar pomeni končno oceno 7.

Drugi primer (zelo dober študent): Seminar 9, poročila 10, vprašanja z vaj 9, teorija 89 %: seštevek točk je 4,5 + 10 + 31,1 + 44,5 = 90,1, ocena 10.

Tretji primer (manj uspešen študent): Seminar 6, poročila 7, vaje 4, teorija 50 %: seštevek točk je 3 + 7 + 14 + 25 = 49, ocena 6.

Literatura

Twyman & Primrose: Principles of Gene Manipulation and Genomics. Oxford: Blackwell Publishing, 2006.