Semikonzervativno podvojevanje
Semikonzervativna replikacija je metoda, po kateri se DNK podvojuje v vseh celicah.
Vsa živa bitja se razmnožujejo. To je ena njihovih osnovnih lastnosti. Ne glede na to, ali so organzimi eno- ali večcelični, razmnoževanje temelji na delitvi celice. Tudi rast in obnavljanje mnogoceličnih organizmov omogočajo delitve celic. Preden se materinska celica razdeli na dve (ali več) hčerinskih celic in jim prenese svoj dedni zapis, se mora ta v njej identično podvojiti, narediti kopijo samega sebe.
DNK se podvaja vedno enako, ne glede na to, ali se podvaja pri prokariontih ali evkariontih. Razlika je le v tem, da pri prokariontih poteka podvajanje v citoplazmi, pri evkariontih pa v jedru. Podvajanje se prične proti koncu interfaze (v podfazi S) in poteka s pomočjo številnih encimov.
Mehanizem semikonzervativnega podvajanja
Podvajanje se prične tako , da encim helikaza razvije dvojno vijačnico (helix) materinske DNK. Med komplementarnimi bazami sosednjih verig cepi vodikove vezi. Začne na določenem mestu in cepi do konca molekule. Polinukleotidni verigi se postopoma razpirata, kari si lahko predstavljamo kot odpiranje zadrge. Razpeti verigi služita kot matrici, ob kateri encim polimeraza DNK pripenja ustrezne nukleotide, ki so prosto v celici (v nukleoplazmi), in jih povezuje v novo verigo. K adenin nukleotidu veže timin nukleotid (in obratno). Tako ob stari, razpeti verigi, postopoma nastaja npva veriga. Verigi ne nastaneta povsem enako. Ena se sintetizira tekoče (vodilna veriga), druga nastaja po fragmentih (zastajajoča veriga), ki jih poveže encim ligaza. Obe pa nastajata v smeri od 5´ ---> 3´ koncu.
Podvajanju, pri katerem se polovica starega ohrani, pravimo semikonzervativno podvajanje. Hčerinski molekuli DNK vsebujeta vsebujeta po eno staro in eno novo polinukleotidno verigo, ki je komplementarna stari verigi. Novonastali hčerinski molekuli DNK sta med seboj enaki (identični), imata enako zaporedje nukleotidov. Enako zaporedje nukleotidov je imela tudi materinska molekula DNK. Novonastali molekuli se lahko podvajata na enak način in to omogoča prenašanje nespremenjenega dednega materiala iz celice v celico, iz generacije v generacijo. Ker se lahko DNK vedno znova podvaja, rečemo tudi da se replicira. DNK se torej semikonzervaivno replicira ali samopodvaja. Lastnost samopodvajanja omogoča ohranjanje kvalitete (vrstnega reda nukleotidov) in kvantitete (števila nukleotidov) DNK v hčerinskih celicah.
Podvajanje se začne na določenem (specifičnem) mestu, ki ni nujno vedno na začetku molekuleDNK. To začetno mesto podvajanja imenujemo "ori". Oznaka izhaja iz angleške besede origin in pomeni začetek. To specifično mesto prepoznajo določeni proteini. Mesto razhajanja dvojne verige DNK imenujemo podvojevalne vilice. Japonski raziskovalec Okazaki je ugotovil, da se novo nastajajoči hčerinski verigi sintetizirata različno. Ena se sintetizira tekoče v smeri od 5´ ---> 3´ koncu. To verigo imenujemo vodilna veriga. Druga veriga sicer tudi nastaja v smeri od 5´ ---> 3´ koncu, vendar nastaja po fragmentih (t.i. Okazakijevi fragmentih) in se imenuje zastajajoča veriga. Polimeraza DNK potrebuje prosto skupino OH na 3´ koncu, da lahko deluje. Če je ni, ne more delovati. Razpete podvojevalne vilice imajo eno verigo s prostim 3´ koncem (ob njej nastane vodilna veriga) in drugo verigo s prostim 5´ koncem. Tega polimeraza ne prepozna in ne more začeti s sintezo nove verige. Zastajajočo verigo začne sintetizirati nov encim, to je primaza (vrsta RNK-polimeraze). Na molekuli DNK so mesta, kamor se ta encim lahko prime. Njegovo delovanje ni pogojeno s prosto OH skupino na 3´ koncu. Ko primaza najde mesto na razprti DNK, kamor se lahko pripne, začne z delom. Najprej sintetizira kratko verigo RNK, ki jo imenujemo začetnik (ang. primer). Vsak nukleotid ima na tretjem ogljikovem atomu v sladkorju prosto skupino OH, kamor se lahko veže nov nukleotid. To prosto skupino OH na 3´ koncu prepozna polimeraza DNK, ki od tu nadaljuje z dodajanjem komplementarnih deoksiribonukleotidov in tako sintetizira del (fragment, ki je dolg približno 1000 nukleotidov) nove verige. Medtem se je DNK še bolj razprla, primaza je naredila nov začetnik in polimeraza DNK nov fragment DNK. Drugi encim iz skupine polimeraz DNK odstrani začetnike (kratka zaporedja nukleotidov RNK) in jih nadomesti z nukleotidi DNK. Vse fragmente v enotno, biološko aktivno molekulo poveže encim ligaza.
Okazaki je ugotovil, da se med podvajanjem ena novo nastajajoča veriga sintetizira tekoče, in sicer v smeri nastajanja podvojevalnih vilic (navznoter), druga pa nastaja v obliki krajših koncev (Okazakijevi fragmentov) v obratni smeri, od razcvepišča podvojevalnih vilic navzven. začetniki so pri prokariontih dolgi 1-3 nukleotide, pri evkariontih pa do 10. Sinteza začetnikov je potrebna zato, ker polimeraza DNK lahko doda nov nukleotid le na tistem mestu, kjer sta enojna DNK kot matrica ter prosta skupina OH na 3´ koncu. Vsaka veriga vedno nastaja v smeri od 5´ ---> 3´ koncu.
Poskus, s katerimi so potrdili semikonzervativno podvajanje
Ko sta leta 1953 James D. Watson in Francis Crick razvozlala strukturo DNK, sta predvidevala, da vsaka od verig dvojne vijačnice služi kot matrica za sintezo nove verige. Kljub temu pa takrat še niso poznali mehanizma, ki bi pojasnil kako se na novo sintetizirane verige kombinirajo z matričnimi in tako tvorijo dve novi dvojni vijačnici DNK. Eksperimentalni dokaz, da se DNK podvaja semikonzervativno in ne kako drugače, sta leta 1958 objavila Meselson in Stahl.
Teorija semikonzervativnega podvajanja je osnovana na dejstvu, da je DNK zgrajena iz dušikovih baz. Pri dušiku poznamo izotop N15 (najbolj pogost izotop je N14) imenovan tudi "težki" dušik. Meselson-Stahl-ov poskus pa izkorišča ravno to razliko v teži med različnimi izotopi dušika.
Bakterije Escerichia coli, ki sta jih gojila, sta razdelila v dve skupini. Kontrolno skupino bakterij E. coli sta gojila na gojišču z običajnim dušikom 14N. Vsa DNK, ki so jo bakterije sintetizirale, je vsebovala 14N in je bila "lahka". Testno skupino bakterij pa sta gojila na gojišču, v katerem je bil edini dostopni dušik težki dušikov izotop 15N. Bakterije sta več generacij gojila na takem gojišču. Vse molekule, ki so bile zgrajene iz dušika - tudi DNK, so vsebovale izotop 15N. Tako je vsa bakterijska DNK postala "težka" in tako so bakterije tudi označili. Z izotopi 15N in 14N označeno DNK so izločili (ekstrahirali) iz celic in jo s centrifugiranjem ločili od ostalih molekul in delov celice. To so naredili tako, da so dali vzorec DNK v centrifugirko na vrh raztopine cezijevega klorida (CsCl) z naraščajočo gostoto. Med centrifugiranjem so se različno težke molekule DNK razporedile po raztopini tako, da so se zadržale tam, kjer je bila gostota raztopine enaka njihovi gostoti. Težje molekule imajo večjo gostoto. DNK s težkim dušikom se je ustavila blizu dna, medtem ko se je lahka DNK zadržala blizu vrha centrifugirke. Vsa DNK iz gojišča 15N je bila "težka", vsa DNK iz gojišča z 14N pa lahka.
Potem sta bakterije, označene z 15N, prenesla na gojišče z normalnim, "lahkim" dušikom 14N in pustila, da so se bakterije enkrat delile. Dobila sta 1. generacijo. S centrifugiranjem sta ugotovila, kakšno gostoto("težo") je imela DNK bakterij prve generacije. Postopek sta ponovila še za 2., 3. in več nadaljnih generacij. Bakterijske celice so se delile vsakih 60 minut.
Preden so nastale hčerinske celice, se je morala DNK v materinskih celicah podvojiti. Podvaja se tako, da se ob stari verigi izdela nova, obe skupaj pa gradita hčerinsko molekulo DNK. Ker je bil kot gradbeni element za novo verigo na voljo le lahki dušik (14N), je bila DNK 1. generacije po gostoti vmes med težko in lahko. V centrifugirki sta opazila samo en pas, ki je ležal med težko in lahko DNK. Tudi za nastanek 2. generacije je bil na voljo samo lahki dušik (14N). V centrifugirki sta opazila dva pasova. Eden je bil na mestu "lahke", drugi pa na mestu "vmesne" DNK. Kako to razložiti? Tokrat sta nastali dve vrsti DNK. Tiste, ki so nastale ob "težki" matrici, so bile po gostoti vmes, tiste pa, ki so nastale ob "lahki" matrici, so bile "lahke". Pri 3. generaciji se je zgodba ponovila. Le pas lahke DNK je bil širši, kar je pomenilo, da je nastalo še več "lahke" DNK kot v 2. generaciji.
Po prvi delitvi je bila vsa DNK vmesne gostote. Hčerinske celice so vsebovale po eno starševsko ("težko") verigo in eno novo nastalo ("lahko") verigo DNK. Po drugi delitvi je bilo 50 odstotkov "vmesne" in 50 odstotkov "lahke"DNK. Komaj polovica celic je vsebovala označene ("težke") molekule DNK - pa še to le eno verigo na celico.
Povzetek
DNK se podvaja semikonzervativno, kar pomeni, da se ob enojni verigi sintetizira nova, ki je stari komplementarna. Iz ene molekule DNK nastaneta dve, ki sta enaki.
Viri in literatura
- Brajkovič, B. Genetika.Ljubljana: DZS, 2006
