Neural stem cells

Uvod

Parkinsonova bolezen je druga najpogostejša degenerativna bolezen (takoj za Alzheimerjevo boleznijo). Bolezen nastane zaradi propada dopaminskih nevronov, ki proizvajajo dopamin in se le-ta ne proizvaja v zadostni koncentraciji, da bi opravljal nalogo živčnega prenašalca. Znaki te bolezni so: mišična rigidnost, upočasnjena gibljivost in značilen tremor. Gre namreč za kronično bolezen, ki sedaj še ni ozdravljiva, pacientu lahko le lajšamo simptome in s tem delno ohranjamo kvaliteto življenja.

Zdravljenje Parkinsonove bolezni (PD) so znanstveniki že izvajali z metodo izvornih celic, vendar se le-ta ni obnesla zaradi mnogih stranskih učinkov. Nato so znanstveniki razvili novo potencialno metodo, ki je vključevale uporabo embrionalnih izvornih celic: nevronske izvorne celice (NSC) in inducirane pluripotentne izvorne celice.

Pri raziskavi so za transplantacijo NSC celic uporabili linijo HBL.F3, saj je le-ta stabilna in ima potencial, da se diferencira v nevronske in glia celice. Prej je bilo možno transplantirane izvorne celice opazovati samo ex vivo z uporabo imunohistokemije, kar pa je vključevalo žrtvovanje ogromno živali in veliko časa. Metoda, ki omogoča ponovitve meritev na eni živali v realnem času, in pri njej ni potrebno žrtvovati živali, je bioluminiscenčno slikanje (BLI).

Modelni organizem

Pri raziskavi so uporabili 8 tednov stare moške miši C57BI/6, ki so jim povzročili Parkinsonovo bolezen z nevrotoksinom. Ta sev miši so uporabili zato, ker je zelo občutljiv na omenjeni nevrotoksin.

Priprava modificiranih izvornih celic (F3-effLuc)

Izvorne celice HB1.F3 so transfecirali z Lenti virusi (ki so bili predhodno pripravljeni v drugih celicah), ki so vsebovali gen z zapisom za okrepljeno kresničkino luciferazo, ki se je izražal na površini F3-effLuc izvornih celic. Okrepljena kresničkina luciferaza proizvede več svetlobe kot navadna, in nam tako omogoča večjo občutljivost z metodo BLI. Za in vitro in in vivo test določitve bioluminiscenco so znanstveniki uporabili D-luciferin, ki se je pretvoril v oksiluciferin in svetlobo katero so detektirali z BLI.

Induciranje PD modela

6-hidroksidopamin (6-ODHA) so vbrizgali intravaskularno v desni striatum miši. To je povzročilo degeneracijo dopaminskih nevronov, kar je vodilo v nastanek Parkinsonove bolezni.

Transplantacija izvornih celic

Štiri tedne po injekciji 6-ODHA so bile F3-effLuc stereotaktično transplantirane v desni striatum, kjer so znanstveniki predhodno povzročili degradacijo dopaminskih nevronov. Transplantirane celice so se zadrževale na desni strani striatuma in niso migrirale v ostale dele možganov.

Rezultati

In vitro luciferazna aktivnost effLuc transfeciranih celic je bila ustrezna. Celice, ki so ekspresirale gen za effLuc so bile določene s pretočno citometrijo in so predstavljale 88,6% vseh celic, kar pomeni da je transfekcija uspela. Izkaže se tudi, da je bioluminiscenca naraščala linearno s številom celic. Več kot je bilo prisotnih F3-effLuc celic, večja je bila bioluminiscenca.

Transplantirane F3-effLuc celice so znanstveniki uspešno videli na možganih vseh miši z uporabo metode BLI. Bioluminiscenčna aktivnost transplantiranih F3-effLuc celic je gradialno padala v primerjavi z ozadjem do dneva 10 (kasneje se bioluminiscence ne zazna več). Zaradi umiranja F3-effLuc celic v tujem organizmu se je bioluminiscenca dnevno zmanjševala.

Pri vedenjskem testu na miših so opazili izboljšanje šele po 4 tednih po transplantaciji, po 4 dneh niso opazili v nobeni preiskovani skupine bistvenih razlik. Injicirali so jim apomorfin (agonist dopamina), in pri PD miših opazili zmanjšanje tremorja in s tem izboljšanje v njihovem vedenju.

Imunohistokemijske raziskave so pokazale, da je bilo na začetku (4 dni po transplantaciji) prisotnih zelo veliko transplantiranih izvornih celic F3-effLuc v striatumu, pozneje (4. tedne po transplantaciji) pa je bilo živih celic bistveno manj. Naredili so tudi raziskave detektiranja apoptotskih celic z metodo »Tunnel stain« in ugotovili, da je bilo na začetku zelo veliko apoptotskih celic, potem pa se apoptoza zmanjšala in s tem tudi delež apoptotskih celic, ker je bilo živih še samo peščica.

Zaključek

Idealen sistem za zdravljenje z izvornimi celicami bi moral imeti dve pomembni lastnosti: dolgo živeče izvorne celice v tujem gostitelju in pa zmožnost diferenciacije v odrasle dopaminske nevrone. In vivo nadzorovanje transplantiranih izvornih celic je tudi ključnega pomena pri zdravljenju Parkinsonove bolezni. V našem primeru je transplantacija F3-effLuc celic v PD mišjem modelu uspela. Transplantirane F3-effLuc celice so uspešno nadzorovali z in vivo BLI sistemom. Le-ta nam omogoča določitev lokalizacije transplantiranih celic v realnem času brez žrtvovanja živali ali nekaterih ostalih invazivnih postopkov.

Dodatno*

Članek: H. Im, D.W.Hwang, H.K. Lee et al. In vivo Visualitation and Monitoring of Viable Neural Stem Cells Using Noninvasive Bioluminiscence Imaging in the 6-Hydroxydopamine-Induced Mouse Model of Parkinson Disease. Molecular Imaging, 2013, letn. 12, str. 224-234.

Dostopno na: Članek na medmrežju